COPD骨骼肌功能障碍与PPARα基因多态性关系研究*

龙翔宇,傅炜萍,何大川,刘 华,张剑青,舒敬奎,戴路明△

(昆明医学院第一附属医院:1.重症呼吸科;2.检验科,昆明650031)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以气流不可逆受限为特征的慢性气道疾病[1],同时也是一种涉及多器官受损的全身疾病。全身主要症状表现为心血管、神经系统受累及骨骼肌功能障碍(skeletal muscle dysfunction,SMD)[2]。人们一直以为COPD患者出现运动受限,主要是因为肺功能受损所致。但近年来越来越多的研究发现,在运动受限的COPD患者中,约40%左右患者的肺功能并没有严重受损,而表现为明显的SMD。过氧化物酶体增殖活化受体α(peroxisome proliferators-activated receptorsα,PPARα)是核受体超家族成员之一,具有抗炎、抗氧化、调节糖脂代谢等功能,并与肌纤维类型有一定关系,目前在COPD SM D研究中受到重视[3]。本实验系探索性研究,选择了昆明地区汉族人群为研究对象,探讨PPARα基因的5个突变位点:rs45550937(C/G),rs45552534(A/G),rs45576140(C/G),rs45528736(A/G),rs45576734(A/G)的基因突变率与COPD患者SMD的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 所有患者都符合COPD全球倡议标准。所有患者都有不可逆的气流受限(吸入β2受体激动剂后1 s用力呼气容积(FEV1)的提升小于预计值的10%或绝对值小于200 mL),所有患者近三周均未使用过全身性的激素。但允许吸入维持剂量的长效激素和(或)支气管扩张剂(β2受体激动剂或胆碱能受体阻滞剂)。排出标准:COPD患者伴有恶性肿瘤、哮喘、支气管扩张症、心功能衰竭、截瘫、最近外科手术、肝肾功能不全、内分泌功能障碍及免疫系统性疾病。按照上述标准,最终纳入昆明地区COPD患者128例。64例年龄相匹配的健康对照者均无亲戚关系,均来自昆明地区。登记所有入选对象的基本资料,包括年龄、性别、吸烟指数、体质量指数(body mass index,BMI)、无脂肪组织指数(fat-free mass index,FFMI,生物电阻抗法测定)、动脉氧分压(PaO2)和肺功能[FEV占预计值的百分比(FEV1%)、1 s用力呼气量占用力肺活量比值(FEV1/FVC%)];对 COPD 患者,以 BMI＞21 kg/m2和BMI≤21 kg/m2,且男性以 FFMI＞16 kg/m2和 FFMI≤16 kg/m2,女性以 FFM I＞15 kg/m2和 FFMI≤15 kg/m2的COPD组患者分为SMD组(BMIL组)和无 SMD组(BMIN组)[4]。一般情况及相关检查见表 1。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取,取外周全血2 mL,EDTA-Na2抗凝,-20℃冰箱保存(不超过6个月)。冰冻血块室温解冻后,采用柱式小量血液基因组DNA抽提试剂盒(上海华舜,批号200903),严格按说明操作,提取外周血白细胞DNA。所提DNA放入-70℃冰箱中保存备用。

1.2.2 PPARα基因多态性分析 在 PUBM ED上查出PPAR α全序列。5个突变位点相邻,最长2个突变位点相距为236个碱基。由于直接设计引物有一定难度,故采用巢式多聚酶链反应(PCR)方法,用Primer Premier设计引物,一扩引物:上游 5′-CTG CTT CCG AGT CCA T-3′,下 游 5′-AAT AGT GAA GGG TCT TTA GCG-3′,扩增体系:DNA 模 板100～300 ng,引物 10 pmol(上海捷瑞提供,下同),dNTP(10 mmol/L)1 μ L,MgCl2(25 mmol/L)1 μ L,10 ×TaqBuffer with KCL 5 μ L,5.0 IUTaqDNA 聚合酶(均为 Fermentas提供,下同),双蒸水调整共50 μ L,反应条件为 94℃预变性 5 min;94℃变性60 s,60℃退火60 s,72℃延伸60 s,共35个循环后延伸5 min。产物长度为1 846 bp(图1)。将一扩产物1 μ L,稀释 30倍,取 1 μ L,为二扩产物模板。二扩引物:上游 5′-TAG GAA AAG TGG TGA CC-3′,下游 5′-CAA AAG AAT CCA AA T GT T-3′,反应体系:1 μ L稀释的 DNA模板,引物 10 pmol,dNTP(10 mmol/L)1 μ L,MgCl2(25 mmol/L)1 μL,10 ×TaqBuffer with KCL 5μ L,5.0 IUTaqDNA 聚合酶,双蒸水调整共50 μ L。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性60 s,48℃退火60 s,72℃延伸45 s,共38个循环后延伸5 min。产物长度为430 bp。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶鉴定后,外送上海生工测序。

表1 一般情况及相关检查

图1 一扩产物结果(1 846 bp)

2 结 果

经过实验,扩增出所需目的片段(图2)。共成功测序184例,其中COPD组123例(BMIL组64例,BMIN组59例),健康对照组61例,失败8例。经比对,在COPD患者BMIL组和健康对照组中,rs45550937(C/G),rs45552534(A/G),rs45576140(C/G),rs45528736(A/G),rs45576734(A/G),5个位点均未发生突变,均为 C、G、C、A、A。所以未对三组间基因型和等位基因进行比较。

图2 二扩产物结果(430 bp)

3 讨 论

COPD是一种以气流不可逆受限为特征的慢性气道疾病。但是越来越多的文献证明COPD不仅单是肺部的疾病,而且是一种涉及肺外表现的系统性的疾病。SMD是COPD的重要并发症,主要表现为肌力下降、肌耐力的下降,易疲劳。其形成机制非常复杂,与全身炎症反应、氧化应激、营养代谢、线粒体功能障碍、细胞缺氧以及缺乏身体锻炼等因素有关,而上述刺激因素均会降低骨骼肌氧化代谢能力,或者使肌蛋白分解/合成过程失衡、影响骨骼肌纤维的凋亡过程,导致SMD[5]。COPD患者的SMD,会进一步恶化患者健康情况,增加医疗费用,影响患者的生活质量,尤其对中、重度COPD患者,骨骼肌的消耗是预计患者死亡率的重要指标[6]。尽管目前临床上使用支气管扩张剂和抗炎药物能改善COPD患者的肺功能,但患者运动受限的症状并没有改善,而目前针对COPD患者骨骼肌萎缩的治疗措施,仍然仅局限在运动锻炼和加强营养方面,这些治疗手段对提高运动耐力没有明显效果。到目前为止,还不清楚COPD患者肌肉受损的分子机制是疾病特异性因素还是慢性消耗性疾病的共同因素。SMD分子机制的阐述是针对改善COPD患者运动功能和健康状况的特异性治疗很关键的一步,对提高患者生活质量非常重要。近年研究发现,一种类固醇激素受体——过氧化物酶体增殖活化受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs),通过介导过氧化物酶体增殖体的活性,调节骨骼肌氧化代谢、促进纤维类型的转换,参与了COPD疾病SMD的发生[5]。PPARs是核受体超家族成员之一,分为 3种类型:PPAR α、PPA R δ、PPARγ。其中,PPARα基因,位于22号染色体,22q12-q13.1,主要分布于骨骼肌中,对维持肌肉的功能代谢有重要作用。

首先,PPARα与骨骼肌氧化能力及肌纤维类型有关。在骨骼肌中PPARα的主要功能是对脂肪酸β-氧化酶的基因转录进行调控,在给予PPAR α激动剂后,肌肉中关于利用脂肪酸的酶的mRNA表达增加。从而增加肌肉组织对脂肪酸的利用,减少糖酵解和乳酸的生成,可增加患者劳动耐力。有证据表明,体育锻炼可增加肌肉中 PPARα蛋白的含量。相反,COPD久坐的生活方式,可致 PPARα减少[4];同时,PPARα对肌肉代谢的影响与肌纤维的类型有关,在COPD患者骨骼肌中,Ⅰ型(慢收缩氧化型肌纤维)向Ⅱ型(糖酵解型快收缩肌纤维)的转换。与Ⅰ型肌纤维相比,Ⅱ型纤维抗疲劳能力较低,这将导致肌耐力的减少。Kramer等[7]发现,PPARαmRNA浓度与Ⅰ型纤维比率呈正相关。其次,不同亚型的PPARs具有强大的抗炎能力。系统性炎症是COPD发病的始动因素,也是COPD患者体质量下降和肌肉萎缩病因学的一个重要因素。许多炎症应答是通过NF-κ B介导的。PPARα可抑制 NF-κ B驱动的炎症因子转录从而减弱炎症应答。在实验小鼠的很多组织中,PPARα的激活可有效地减少NF-κ B激活所致的炎症因子(如IL-6、TNF-α)的产生[8]。在 COPD患者中,Remels等[8]发现,血中炎症因子的水平与股外侧肌肉中 PPARα的mRNA水平负相关。大量的研究表明,PPARα具有减弱或抑制氧化性应激作用。在COPD患者,氧应激不仅是系统性的,而且在局部骨骼肌亦存在。实验研究表明,活性氧族(ROS)可增加骨骼肌蛋白分解,抑制肌肉特异性蛋白的表达,增加肌肉细胞的凋亡。此外,有研究表明,在COPD骨骼肌中,硝化应激的标志是增加的[9]。通过直接阻止ROS基因表达,PPAR α激动剂能直接减弱氧化性应激和硝化应激[4];而且,ROS的产生与线粒体膜电位有关,膜电位与线粒体膜上解偶联蛋白3(UCP3)的表达有关,UCP3基因的上游有PPARα作用元件。故PPARα亦可通过调节 UCP3基因来调节ROS的产生[10]。

近年来对PPARα基因的研究主要集中在与代谢性疾病的关系上,已经发现 PPA R α基因多态性与冠心病、2型糖尿病的发病有关[11-12]。国外多篇文献表明,PPARs各亚型的含量和活性的减少与COPD SMD明显相关,这是非常具有吸引力的。目前多项研究证实,PPARα可减弱或抑制氧化性应激,对代谢有强大的调节能力,有潜在的抗炎能力。因此推测,PPAR α激动剂或许可能成为治疗 COPD患者的一个靶标[4,13]。基于上述研究,本研究假设PPARα基因多态性与骨骼肌组织中PPARα蛋白含量及活性有关,从而与COPD SMD相关。但目前很少有人研究PPARα的多态性与COPD患者SM D的关系,且本实验所选5个突变位点的突变概率及其临床意义在国内外均未见报道。本研究证实,上述5个突变位点在昆明地区汉族人群突变概率低,与COPD SMD无明显关系。需要进一步筛查PPARα基因的其他突变位点的多态性与COPD患者SMD的关系。

[1]李俊兰.COPD患者不同时期血清IL-8变化及其临床意义[J].重庆医学,2008,37(20):2329.

[2]Agusti AG,Noguera A,Sauleda J,et al.Systemic effects of chronic obstructive pulmonary disease[J].Eur Respir J,2003,21(2):347.

[3]Remels AH,Gosker HR,Schrauwen P,et al.Peroxisome proliferator-activated receptors:a therapeutic target in COPD?[J].Eur Respir J,2008,31(3):502.

[4]Remels AH,Schrauwen P,Broekhuizen R,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor expression is reduced in skeletal muscle in COPD[J].Eur Respir J,2007,30(2):245

[5]龙翔宇,戴路明.慢性阻塞性肺疾病骨骼肌功能障碍分子机制研究进展[J].国际呼吸杂志,2009,29(10):1182

[6]Swallow EB,Reyes D,Hopkinson NS,et al.Quadriceps strength predicts mortality in patients with moderate to severe chronic obstructive pulmonary disease[J].Thorax,2007,62:115.

[7]Kramer DK,Ahlsen M,Norrbom J,et al.Human skeletal muscle fibretype variations correlate with PPARα,PPARδand PGC-1α mRNA[J].Acta Physiol(Oxf),2006,188:207.

[8]Remels AH,Gosker HR,van der Velden J,et al.Systemic inflammation and skeletal muscle dysfunction in chronic obstructive pulmonary disease:state of the art and novel insights in regulation of muscle plasticity[J].Clin Chest Med,2007,28(3):537.

[9]Barreiro E,Rabinovich E,Marin-Corral J,et al.Chronic endurance exercise induces quadriceps nitrosative stress in patients with severe COPD[J].Thorax,2009,64:13.

[10]马国栋,张勇.运动与解偶联蛋白3(UCP3)介导的线粒体活性氧代谢调控研究进展[J].西安体育学院学报,2007,24(4):63.

[11]Balcerzyk A,Zak I,Krauze J.Synergistic effect between polymorphisms of PPARA and ABCA1 genes on the premature coronary artery disease[J].Acta Cardiol,2007,62(3):233.

[12]Andrulionyte L,Kuulasmaa T,Chiasson JL,et al.Single nucleotide polymorphisms of the peroxisome proliferatoractivated receptor-alpha gene(PPARα)influence the conversion from impaired glucose tolerance to type 2 diabetes:the STOP-NIDDM trial[J].Diabetes,2007,56(4):1181.

[13]Belvisi MG,Hele DJ.Peroxisome proliferator-activated receptors as novel targets in lung disease[J].Chest,2008,134(1):152.