海南岛葫芦科蔬菜根结线虫危害性调查与种类鉴定初报

黄伟明， 陈绵才， 肖彤斌， 王会芳

（1.海南大学环境与植物保护学院，儋州 571737；2.海南省农业科学院农业环境与植物保护所，海口 571100）

根结线虫（Meloidogynespp.）是一类可侵害多种农作物的重要植物土传病原物，全世界每年因其造成的经济损失达1 000亿美元以上［1］，对蔬菜、花生、烟草和果树造成的产量损失超过20%［2］。海南地处热带，冬季蔬菜种植已成为促进当地农业经济增长的重要支柱产业。以瓜类、茄果类和豆类为主体的反季节瓜菜年栽培面积约10万hm2。由于可耕地面积有限，使得土地复种指数逐年提高，许多菜区甚至连年栽种相同类型的作物，造成产量和品质不同程度下降，其中一个最主要原因是根结线虫病的不断累积、传播、蔓延和危害所致。至目前国内已报道的根结线虫近40种，寄主涉及2 000多种植物，但不同生境下其种类分布复杂，种间乃至种内存在着一定的寄主专化性［3］。作者针对海南岛独特的地理和气候条件下根结线虫侵染葫芦科蔬菜的状况进行调查，并对病原的种类进行鉴定，以期为当地蔬菜根结线虫病综合防治技术体系的组建和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 根结线虫危害性调查

于2008年10月至2009年2月从海南岛11个市县葫芦科蔬菜主产区采样，采样点及寄主如表1。选取受害严重植株，挖开表土，观察其根部根瘤数量，判断是否感染根结线虫，并拍照。按五点法取样，每点调查2株，每块地共调查10株，进行病情分级和记载，计算根结指数。

病情分级标准：0级－根系无根结；1级－根系有少量根结；3级－2／3根系有虫瘿；5级－根系布满小根结，并有次生根结；7级－根系形成根结团［4］。

1.2 样本采集与培养

挖取根部土壤约500 g和染病根，置于塑料袋中，封口并标记。温室条件下将病根和病土接种到预先用灭菌土培植的盆栽番茄上，保存线虫原始种群，45 d后从染病番茄根系上挑取单卵块进行纯化培养。

1.3 会阴花纹制作与鉴定

用挑针在体视显微镜下解剖根结，每个种群挑取成熟雌虫20头移入硬塑料板上清水滴中，剔除杂物并进行修切，清水中清洗3次，然后将包含完整会阴花纹且大小合适的角质膜转移到载玻片上，加盖玻片。干燥后，在显微镜下观察会阴花纹的形态特征并拍照。

1.4 同工酶分析

根结线虫的苹果酸脱氢酶（Mdh）和酯酶（Est）同工酶的活性分析参照Esbenshade等的程序［5］。采用7%聚丙烯酰胺胶垂直电泳，胶厚为1.5 mm，每孔加入20头纯化培养的年轻雌虫酶提取物。电泳后，将胶在苹果酸脱氢酶染液中染色5～10 min至出现清晰的酶条带，然后将同一胶在酯酶染色液中染色20～30 min至出现清晰的酶条带为止。以已鉴定的爪哇根结线虫（M.javanica）样本作为参照系。苹果酸脱氢酶和酯酶表型的命名按照Esbenshade等的方法［6］。

2 结果与分析

2.1 根结线虫危害性

调查结果表明，海南岛葫芦科蔬菜受根结线虫的危害严重，被调查菜田的株发病率均在50%以上，澄迈县的丝瓜和苦瓜、琼中县的南瓜发病率高达100%。琼海中原、琼中腰子、临高多文、澄迈长安、临高龙波、琼中营根、五指山茶场、定安雷鸣等8个主产菜区的病情指数均超过30。其中琼中腰子、澄迈长安和琼中营根3个采样点的病情指数分别达到了47.12、47.14和40（表1）。

表1 海南葫芦科蔬菜根结线虫危害调查结果

2.2 根结线虫形态学鉴定

对雌虫会阴花纹进行显微镜观察，发现雌虫会阴花纹变异很大，初步认为寄生于葫芦科蔬菜的根结线虫种类有南方根结线虫（Meloidogyneincognita）、爪哇根结线虫（M.javanica）和疑似新种或新纪录种（Meloidogynesp.）。

南方根结线虫形态特征描述：雌雄异形，雌虫虫体膨大，呈球形或梨形，有明显突出的颈部，唇区稍突起，略呈帽状；会阴花纹变异较大：花纹呈椭圆形或近圆形，通常背弓高，背弓顶部圆或平，有时呈梯形，背纹紧密：花纹背面和侧面的线纹呈波浪形或锯齿状，有的平滑，侧线不明显，侧面线纹有时分叉。2龄幼虫线形［7］。所有调查的市县均有分布。

爪哇根结线虫形态特征描述：雌雄异形，雌虫虫体膨大，近球形至洋梨形，有突出的颈部，唇区有1个环纹；会阴花纹背弓圆而扁平，线纹平滑至波浪形，有一清楚的侧线将花纹的背线和腹线分开，分为明显的背区和腹区，一般无线纹通过侧线。2龄幼虫线形［8］。主要分布在临高、五指山和万宁3个市县。

疑似新种或新纪录种Meloidogynesp.形态特征描述：雌雄异形，雌虫虫体膨大，呈球形或梨形，有突出的颈部，唇区稍突起，呈锥状；会阴花纹肩部明显，背弓高，线纹平滑，侧线不明显，侧面线纹分叉明显。2龄幼虫线形。主要分布在琼海和儋州。

图1 海南省侵染葫芦科蔬菜的根结线虫雌虫代表性会阴花纹（400×）

2.3 同工酶鉴定结果

在供试种群中，共测得酯酶谱带类型3种，结合比较形态学特征，分别判定为I1（Rf为0.470），代表M.incognita的酯酶谱带类型；J3（Rf为0.460、0.545和0.590），代表M.javanica的酯酶谱带类型；S1－M2a（Rf为0.465和0.480），基于其独特性，认为代表1个疑似新种或新纪录种Meloidogynesp.的酯酶谱带类型（图2）。

图2 海南省侵染葫芦科蔬菜根结线虫群体的苹果酸脱氢酶和酯酶表型

通过同工酶电泳技术与比较形态学相结合的方法，鉴定了海南岛葫芦科蔬菜上24个根结线虫种群，有19个属于南方根结线虫，占总数的79.17%；有3个属于爪哇根结线虫，占总数的12.5%；有2个属于疑似新种或新纪录种Meloidogynesp.，占总数的8.3%。南方根结线虫是海南葫芦科蔬菜上的优势种。

3 结论与讨论

海南岛葫芦科蔬菜严重遭受根结线虫危害，所调查的主产区植株发病率均高于50%，这与该地区土地利用率增高有关。海南岛是我国反季节蔬菜的重要种植基地，复种指数的增加，导致了根结线虫种群数量在土壤中逐年增大，生产上应引起注意。建议采用水旱轮作，延长非寄主作物的种植年限，降低根结线虫基数，有条件的地方可以采取阳光消毒和生物熏蒸的措施，以减少土壤中的线虫数量。

运用比较形态学和同工酶方法鉴定出海南葫芦科蔬菜根结线虫有南方根结线虫、爪哇根结线虫和1个疑似新种或新记录种，其中南方根结线虫为优势种，这与前人报道的结果基本相符［9－10］。疑似新种或新纪录种的形态学和同工酶谱带均有别于常见4个种，但由于获得和掌握可比对试验数据的局限性，有待于进一步开展其分子特征观察与遗传背景分析予以准确鉴定与描述。

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［3］刘昊，龙海，鄢小宁，等.海南省番石榴根结线虫病病原的种类鉴定及其寄主范围的测试［J］.南京农业大学学报，2005，28（4）：55－59.

［4］王佩圣，刘岐茂，冯明祥，等.3种杀线虫剂对番茄根结线虫的防治效果［J］.中国蔬菜，2007（10）：28.

［5］Eisenback J D，Triantaphyllou H H.Root－knot nematodes：Meloidogynespecies and races［M］∥Nickle W R，ed.Manual of agricultural nematology.New York：Marcel Dekker，1991：191－274.

［6］Esbenshade P R，Triantaphyllou A C.Use of enzyme phenotypes for identification ofMeloidogynespecies［J］.J Nematol，1985，17（1）：6－20.

［7］Hirschmann H.The genusMeloidogyneand morphological characters differentiating its species［C］∥Sasser J N，Carter C C.An advanced treatise onMeloidogyne，Vol.Ⅰ：Biology and control.Ralegh：North Carolina State Univ Graphics，1985：79－93.

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［9］廖金铃，蒋寒，孙龙华，等.中国南方地区作物根结线虫种和小种的鉴定［J］.华中农业大学学报，2003，22（6）：544－548.

［10］喻盛甫，杨宝君，王秋丽.云南植物根结线虫种类调查与鉴定［J］.云南农业大学学报，1990，5（4）：212－217.