Toll样受体4、9mRNA在带状疱疹患者外周血单个核细胞中的表达及意义

吴佳理，刘 源，龚少智，赵 敏，张信江

（遵义医学院附属医院 皮肤性病科，贵州遵义563000）

带状疱疹(Herpes Zoster，HZ)是由水痘-带状疱疹病毒引起的急性炎症性皮肤病。初次感染表现为水痘或呈隐匿感染，以后病毒沿神经末梢进入神经节，可长期潜伏在脊髓后根神经节内。当机体细胞免疫功能低下，病毒被激活，通过复制、增殖、变异表现出抗原性，诱发免疫应答[1]，发生HZ。 Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是固有性免疫系统中的细胞跨膜受体及一种病原体识别受体,主要参与对细菌、真菌、病毒、衣原体等病原微生物的天然免疫反应。为了探讨TLRs是否参与了HZ的免疫反应，我们采用实时荧光定量PCR技术对带状疱疹患者外周血单个核细胞（peripheral biood monouclear cells，PBMC）的TLR4、9mRNA的表达进行了研究，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 30例带状疱疹患者均是我院皮肤科门诊急性感染病人，无用药史。其中男18例，女12例，年龄15～82岁，平均61±21.22岁，病程2～5d，发病部位分别为眼部、胸部、腰部、股外侧。对照组20例，均为我院在读研究生，其中男11例，女9例，年龄25～33岁，平均28.65±2.37岁，抽血前一个月内无细菌、真菌、病毒等感染史。

1.2 试剂、仪器与引物 密度梯度离心试剂（美国SIGMA公司），紫外分光光度计（美国Beckman公司），PCR 扩增仪 iCycler iQ (美国 Bio-Rad公司)，RNAiso Reagent、逆转录试剂盒及PCR反应试剂盒（自宝生物工程有限公司）（见表1）。

表1 TLR4、TLR9和 β-actin引物序列

1.3 方法

1.3.1 PBMC分离 静脉血4ml置枸橼酸抗凝管摇匀，采用密度梯度离心试剂分离外周血单个核细胞。1.3.2 细胞总RNA的抽提 采用Trizol一步法抽提分离的PBMC，用紫外分光光度计测定其总RNA的浓度及纯度，筛选OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的样品，计算每份样品的浓度，将全部样品的浓度都配成统一的50ng/μl。

1.3.3 逆转录 按逆转录试剂盒的操作说明进行，将上述抽提的RNA逆转录成cDNA。

1.3.4 实时荧光定量PCR 分别选择目的基因TLR4、TLR9作为标准品建立标准曲线，得到样品中相应目的基因的Copy数；同时以管家基因β-actin作为内参建立标准曲线，得到样品中管家基因的Copy数，将目的基因和管家基因的Copy数进行校准，最后得到的Copy数即为目的基因的定量。TLR4、TLR9及β-actin的反应体系为：SYBR Premix Ex Taq(2 × )10ul，PCR Forward Primer(10μM)0.4μl，PCR ReversePrimer (10μM)0.4ul，模板（cDNA）溶液 2ul，dH2O 7.2ul。总反应体系为 20ul。扩增条件如下：预变性95℃10 s，1Cycle；PCR反应95℃5 s，60℃20 s ，40 Cycles；融解曲线分析 95℃0 s，65℃15s，95℃0 s。

1.4 统计学处理 采用2－△△ct法进行相对定量。使用统计学软件SPSS15.0对各组数据进行t检验，以α=0.05为检验标准，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Real Time PCR反应结果

2.1.1 Real Time PCR扩增曲线、融解曲线及标准曲线如下（图1-2示TLR4）：

图1 TLR4扩增曲线图（30份样本）

图2 TLR4融解曲线图（30份样本）

2.1.2 结果分析 经融解曲线可知，无论哪一种浓度的模板都可得到单一的PCR扩增产物，标准曲线线性关系较好，可以在实验范围内进行准确定量。

2.2 统计学结果 与正常对照组相比，带状疱疹患者外周血中TLR4、tTLR9mRNA的表达都明显上升，其 t检验 TLR4（t=2.32，P=0.028），TLR9（t=2.27，P=0.031），均在0.05水平上，具有显著的统计学意义（见表2）。

表2 病例组和正常对照组TLR4、TLR9mRNA的表达（s）

表2 病例组和正常对照组TLR4、TLR9mRNA的表达（s）

组别 TLR4 TLR9病例组 6.51±1.30 2.24±4.91对照组 0.91±0.37 1.83±0.76

3 讨论

TLRs的主要生物学功能是促进细胞因子的合成与释放、引发炎症反应[2]，通过识别配体、转导信号、激活特定基因的表达发挥作用[3]。不同的TLRs由于其胞外区氨基酸组成的差异导致其有不同的特征性配体，如TLR2主要识别脂蛋白和肽聚糖，TLR4识别脂多糖，对病毒的识别而言，其中TLR2、TLR4主要识别病毒的蛋白中的成分[3]，TLR9则主要识别具有CPG结构的DNA病毒[4]；TLR4介导呼吸道合胞病毒（RSV）的融合蛋白（F蛋白）并诱生促炎细胞因子；TLR9识别DNA病毒的CPG结构，通过MyD88依赖的信号传导途径激活NF-κB，AP1和IRF-7等转录因子和蛋白激酶，释放TNF-α，IL-6，IL-8等炎症介质和I型干扰素(IFN-α/β)，介导急性炎症反应，诱发Th1型细胞免疫应答[5]。由TLRs介导的信号通路分为MyD88依赖型和MyD88非依赖型，其中TLR9介导的信号通路属于MyD88依赖型信号通路，而TLR4介导的信号转导，包括MyD88依赖性和非依赖性两个途径[6]。

我们采用实时荧光定量PCR技术对带状疱疹患者PBMC中TLR4、TLR9的表达进行了检测，结果显示，4、9mRNA的表达水平较正常对照组升高，具有显著的统计学差异。提示：在HZ患者细胞免疫功能低下时，潜伏在脊神经后根的水痘-带状疱疹病毒被激活，TLR4、9mRNA通过对水痘-带状疱疹病毒的识别，介导信号转导通路，启动相关基因的表达，促进细胞因子的合成与释放，诱发细胞免疫应答，产生急性炎症反应，发挥了早期的天然免疫反应。这一结果显示TLRs可能参与了对水痘-带状疱疹病毒的识别及抗病毒免疫，但TLRs对抗水痘-带状疱疹病毒的免疫机制还有待进一步研究。

[1]魏爱华,刘永,尹晓慧,等.带状疱疹患者细胞免疫功能的检测及意义[J].中国麻风皮肤病杂志,2006,22（3）：234.

[2]何凤莲，张妍蓓.Toll样受体的研究进展[J].国际呼吸杂志，2006,26（9）：655-659.

[3]冯悦.病毒相关Toll样受体研究进展[J].现代免疫学,2007,27（5）：434-438.

[4]Ahmad-Nejad P，Hacker H，Rutz MP，et al.Bacterial CpGDNA and lipoploysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments[J].Eur J lmmunol，2002，32(3):1958-1968.

[5]ChatelherS,KotbM.Preferential stimulation of human lymphocytes by oligodeoxynucleotides that copy DNA CpG motifs present in virulent genes ofgroupA streptococci[J].Eur J Immuno,l 2000,30(4):993-1001.

[6]Akira S，Takeda K.Toll-like receptor signalling[J].Nat Rev Immunol，2004，4(7):499-511.