三七含量测定方法的改进

胡双丰 胡志刚

1 宁波市药品检验所（315040）

2 宁波四明大药房有限责任公司（315000）

《中国药典》（2005年版一部）收载的三七含量测定方法，系采用HPLC法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1三种成分的总量[1]。但在该项检测中，对色谱条件所规定的洗脱梯度和供试品溶液的制备方法操作起来颇感费时，笔者对此两点试作了一些改进（除此两点外，其余仍按原有规定执行），使操作时间大为缩短，收效良好，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪系列（美国），DAD二极管阵列检测器；METTLER. CP225D电子分析天平（上海）。

1.2 试药

对照品：①三七皂苷R1（批号110745-200312）；②人参皂苷Rg1(110703-200726，含量97.7%)；③人参皂苷Rb1(110704-200420)，均为中国药品生物制品检定所提供（供含量测定用）。供试品：三七（粉）3批，饮片均为宁波市药材公司最近两年商品，以下简称S1、S2、S3。所用化学试剂为色谱纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备方法改进

2.1.1 药典原有供试品溶液制备方法

取本品粉末（过四号筛）0.6g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，放置过夜，置80℃水浴上保持微沸2h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 改进后的供试品溶液制备方法

取本品粉末（过四号筛）0.6g，精密称定，精密加入甲醇50mL，称定重量，放置2h，时时振摇，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件中流动相洗脱梯度改进

2.2.1 药典原有色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；；检测波长为203nm，理论板数按三七皂苷R1峰计算应不得低于4000（表1）。

表1 药典规定的梯度洗脱

2.2.2 改进后流动相洗脱梯度

见表2[2]。

表2 改进后的梯度洗脱

2.3 实验中保持不变的其他相关因素

2.3.1 未加改动的色谱条件部分

色谱柱为VenusllXBP-C18，4.6 mm×150mm 5μm；柱温35℃，柱压80bar， 进样量10μL， 流动相（乙腈-水，梯度）流速1.0mL/min，每针stop time=23.50min（或cp方法66min），post time=3.0min；检测器DAD，检测波长203nm，积分参数：Slope=5；peak width=0.05。对照品溶液浓度：每1mL含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1分别为0.1032、0.4272、0.4236mg（溶剂为甲醇）。

理论板数（N）按三七皂苷R1峰计算，采取改进方法所测得的N值为28376（远大于4000）；人参皂苷Rg1与三七皂苷R1的分离度R= 5.43，人参皂苷Rb1与前一峰的R=2.17，均＞2，符合药典要求。采用改进的方法操作，每针运行的时间从66min减少到23min。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 3种被测成分的保留时间（tR）分别是9.373、10.604、20.635min；然而采用药典的方法操作，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 3种成分的tR分别是23.402、26.983、54.794min，节约时间一半以上。两种方法的HPLC图谱见图1～图4。

2.4 加样回收率试验

取已知含量的供试品（S1）5份，每份0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入每1mL各含0.2mg的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及含0.05mg的三七皂苷R1对照品溶液1mL，采取改进的方法制备供试品溶液和改良的梯度洗脱，注样测定，计算加样回收率，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1三者的加样回收率分别是95.45%、99.21%、98.13%，RSD分别是2.1%、1.7%、1.8%。

图1 采用改进方法所得HPLC图谱-1（垒加图）

图2 采用改进方法的HPLC图谱-2（叠加图）

图3 采用药典方法的HPLC图谱-1

图4 采用药典方法的HPLC图谱-2

2.5 精密度试验

取同一份供试品溶液（S1），重复进样5次，RSD=0.42% (n=5)。

2.6 重复性试验

取同一批供试品（S1），精密称取5份，每份0.6g，按改进方法制备供试品溶液和改良的梯度洗脱，注样分析，计算总含量，RSD为1.5% (n=5)。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液（S1）分别在制备后0、1、4、8、24、48h进行分析，记录峰面积，RSD为2.0%。表明溶液在48h内相对稳定。

2.8 样品测定结果

取上述3批三七粉末，每批平行取样6份，每份取0.6g，精密称定。每2份一组，共3组，第一组选用改进的流动相操作，但供试品溶液提取方法仍按照药典进行；第二组选用改进的流动相和超声提取方法操作；第三组完全照药典方法操作。分别制备样品溶液及对照品溶液，各取10μL进样测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积，以峰面积外标法计算3种成分的总含量（规定按干燥品计算，3种成分总量不得少于5.0%），结果如下（表3～表5）。

表3 采用改进方法的测定结果-1

表4 采用改进方法的测定结果-2（超声提取）

表5 采用药典方法的测定结果

3 小结与讨论

3.1 从3批样品测定结果看，第一组与第三组比较，改进流动相的洗脱梯度与药典洗脱梯度的含量测得值基本相当；第二组与第三组比较，两组的含量值也很接近，即表明无论改良流动相的洗脱梯度，还是改进供试品溶液提取方法，都不影响目标成分含量的准确测定，而只会缩短检测时间，简化操作步骤，节俭人力物力。如按药典方法，原本需要2d的工作，选用本文的改进方法则仅需1d即可完成。从方法考察结果看，本文的改进方法具有较好的精度和准确性，可用于三七含量测定。

3.2 在供试品溶液制备中，超声提取前必须冷浸[3]，至少2h，若加以振摇则更佳，以促使植物细胞膨胀，被测组分易于释放溶出，而浸出杂质相对较少。

[1]国家药典委员会.中国药典[S]. 2005年版. 一部. 北京:化学工业出版社,2005:10

[2]国家药品监督管理局:国家药品标准(试行)WS3-B-3590-2001(Z)[S].2001.

[3]中国医科院药物研究所.中草药现代研究[S].第三卷.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997:193.