饲料中添加包膜丁酸减少沙门氏杆菌在家禽肠道中定植和排泄规律的研究

万晓莉 （译） 杨在宾 （校）

（摘自:Poultry Science，2005（84）：1851-1856；原文作者：Van Immerseel,F 等）

欧洲一项新法规规定，所有成员国必须执行对家禽沙门氏杆菌的监控 (EuropeanParliament等,2003a、b)。注射疫苗可以减少产蛋期母鸡体内的细菌定植和蛋的污染(Davies等,2003a;Van Immerseel等，2005)。由于肉仔鸡饲养期短，不推荐使用疫苗 (Van Immerseel等，2005)。生产中常使用母源抗体和抗菌饲料添加剂，并结合卫生检测等联合手段防控肉仔鸡沙门氏杆菌的感染 (Methner等，1997；Van Immerseel等2002；Davies等，2003b)。

短链脂肪酸具有杀菌作用，生产中已经广泛应用于肉仔鸡沙门氏杆菌的控制。市场上常用的短链脂肪酸有两种制剂类型：无膜制剂和包膜酸制剂。无膜制剂即粉末或液体产品，主要添加到饲料或饮水中以杀灭其中的沙门氏杆菌，由于无膜制剂快速吸收，其作用仅限于嗉囊(Thompson等,1997)。所有对沙门氏杆菌有抗菌作用的酸都可以制成包膜制剂 (Al-Chalaby等，1985；Hume 等，1993；Moore 等，2004)。包膜或胶囊制剂需要用矿物质或脂类做载体，将短链脂肪酸进行包膜或胶囊处理，把酸带到鸡的肠道，使肠上皮细胞与酸直接接触，同时这些酸可以改变肠内微生物区系的组成，而且有利于在沙门氏杆菌诱发上皮细胞发病的关键部位，使酸与沙门氏杆菌密切接触。因此，应该科学选择包膜处理的复合酸制剂，以发挥短链脂肪酸的杀菌或者更复杂的作用。有研究表明，包膜丁酸控制沙门氏杆菌定植的作用强于包膜甲酸，更优于包膜乙酸(Van Immerseel等，2004a)。丁酸能抑制致病基因的表达和体外沙门氏杆菌对上皮细胞的入侵，乙酸则不能(Lawhon 等，2002；Van Immerseel等，2004b)。据了解，有关丁酸对鸡沙门氏菌菌群作用的报道只有一项，是对无特定病原体（SPF）产蛋型雏鸡的研究(Van Immerseel等，2004a)，对肉仔鸡的研究还未见报道。

该研究通过两个实验即实验一，比较了粉末和包膜丁酸制剂控制无特定病原体（SPF）鸡早期口腔接种肠炎沙门氏杆菌在体内定植的作用；实验二评估了包膜丁酸对从感染肠炎沙门氏杆菌到屠宰年龄的肉仔鸡沙门氏杆菌定植的作用效果。

1 材料和方法

1.1 沙门氏杆菌

本研究所用76Sa88品系4型肠炎沙门氏杆菌，是从养禽场中分离的一个典型品系 (Desmidt等，1997、1998)，在溶菌肉汤（LB）培养基中培养6 h，随后在亮绿琼脂培养基（BGA;Oxoid,Basingstoke,England）中培养稀释10倍的细菌悬浮液，计算每毫升菌落形成单位数量，然后用磷酸盐缓冲液稀释到接种所需浓度。

1.2 实验鸡

实验一：无特定病原体罗曼白鸡 (Iffa-Credo,Brussels,Belgium)孵化雏鸡，隔离舍饲。每次实验开始前，处死20只处于孵化期的鸡，用抗肠炎沙门氏杆菌酶联免疫吸附分析法（ELISA）(Desmidt等，1996)检测其血清样品中的肠炎沙门氏杆菌母源抗体，检测结果均显阴性。鸡只自由饮用高压灭菌水，自由采食照射饲料(采用 25 kGy of γ-irradiation 照射)，饲料中补充1.3节饲料添加剂。

实验二：选择当地同一孵化场的接种疫苗的1日龄相同亲本的罗斯肉仔鸡。未检测母源抗体，随机分为两组，每组50只。试验鸡自由饮水，饲喂小麦基础日粮。

1.3 饲料添加剂

两种丁酸制剂：第一种是粉末丁酸盐，含98%n-丁酸钠盐的白色或米黄色粉末；第二种是包膜丁酸钠盐：含30%正丁酸钠盐的微胶囊。

1.4 实验步骤

实验一：无特定病原体罗曼白鸡随机分4个处理，每个处理25只，在孵化当天检测泄殖腔拭子沙门氏杆菌。从孵化当天（雏鸡1日龄），第1、2、3个处理组的日粮中分别添加0.63 g/kg粉末丁酸制剂、2.5 g/kg包膜丁酸制剂和复合丁酸制剂（0.315 g/kg粉末丁酸+1.25 g/kg包膜丁酸），3个处理组有效丁酸 (或钠盐)数量相同。第4个处理组为对照（不添加丁酸制剂）。第5 d，所有 SPF蛋鸡用塑料管口腔接种 106CFU 76Sa88肠炎沙门氏杆菌。第6 d，取泄殖腔拭子检测沙门氏杆菌。第8 d，处死所有鸡，从盲肠、肝脏和脾脏取样进行细菌学检验。

实验二：选择1日龄罗斯肉仔鸡100只，随机分2个处理，每个处理50只。检测所有鸡的泄殖腔拭子沙门氏杆菌。从孵化当天开始，处理1组饲喂以小麦为主的幼雏开口日粮，10 d后换成肉仔鸡日粮。处理2饲料中添加2.5 g/kg包膜丁酸。孵化后第5 d，每个处理10只肉仔鸡口腔接种105CFU 76Sa88肠炎沙门氏杆菌。在第 6、9、13、20、27、34 和 41 日龄，对所有鸡的泄殖腔拭子进行细菌学检验。第42日龄，静脉注射T61处死所有肉仔鸡，从盲肠采样进行细菌学检验。

1.5 细菌学检验

泄殖腔拭子在亮绿琼脂培养基上直接接种细菌，37℃培养过夜。直接接种后呈阴性，在缓冲蛋白胨水培养基(Oxoid)中，37℃过夜培养预增菌，然后取1 ml加入9 ml亮绿肉汤培养基中(Oxoid)。培养过夜后，取1滴悬浮液，用亮绿琼脂培养基继续培养。计算沙门氏杆菌阳性鸡所占比例，用SPSS 10.0软件进行二元回归分析统计，分析沙门氏杆菌阳性鸡所占比例在不同时间点的差异。

从盲肠、肝脏和脾脏采样，使其均质化，分别用5、10、20倍缓冲蛋白胨水培养基稀释液稀释10倍。取每种稀释液6×12 μl接种到亮绿琼脂培养基上。过夜培养（37℃）后，对形成的菌落计数，以计算每克组织的菌落形成单位。对滴定后呈阴性的样品预增殖或增殖，如前所述。用SPSS10.0软件统计分析4个不同处理携带一定范围细菌数的鸡只数量的差异，如表1～表3所示。非参数秩合检验（秩和检验是非参数检验中检验效率比较高，而且又是最常用的一种方法）检测固定误差，非参数曼-惠特尼检验（曼-惠特尼检验又称“曼-惠特尼秩和检验”，是由H.B.Mann等于1947年提出的。它假设两个样本分别来自除了总体均值以外完全相同的两个总体，目的是检验这两个总体的均值是否有显著的差别。）检测组间的显著差异(Maxwell等,1990)。

2 结果与讨论

2.1 粉末和包膜丁酸制剂控制SPF鸡早期口腔接种肠炎沙门氏杆菌在体内定植的比较

泄殖腔拭子接种肠炎沙门氏杆菌之前雏鸡呈阴性，感染后1 d的泄殖腔拭子检测，沙门氏杆菌定植阳性的鸡只数量为：对照组10只，添加粉末丁酸组8只，包膜丁酸组4只，复合丁酸组3只（即实验一第6 d，取泄殖腔拭子检测沙门氏杆菌得到的结果）。

表1 无特定病原体蛋鸡5日龄口腔接种106CFU 76Sa88肠炎沙门氏杆菌，8日龄时盲肠中肠炎沙门氏菌定植检测①

表2 无特定病原体蛋鸡5日龄口腔接种106CFU 76Sa88肠炎沙门氏杆菌，8日龄时肝脏中肠炎沙门氏菌定植检测①

表3 无特定病原体蛋鸡5日龄口腔接种106CFU 76Sa88肠炎沙门氏杆菌，8日龄时脾脏中肠炎沙门氏菌定植检测①

每克盲肠菌落形成单位的数目明显不同，如表1所示。添加包膜丁酸或复合丁酸，盲肠中大于106CFU/g菌落明显低于其他两组（P＜0.05）。肝脏中菌落在所有处理中都较少（见表2），统计分析表明，饲料中添加复合丁酸，可使肝脏中大于103CFU/g菌落明显少于其他处理（P＜0.05）。同时，添加复合丁酸，脾脏中大于104CFU/g菌落明显低于（P＜0.05）对照组和添加粉末丁酸盐处理组（见表3）。上述统计分析表明，不同处理在不同器官表现出菌落的鸡只数分布不同。

2.2 饲料中添加包膜丁酸减少沙门氏杆菌在家禽肠道中定植和排泄的规律

对泄殖腔拭子检验呈阴性的鸡只，接种肠炎沙门氏杆菌后1周和3周（12和27日龄），对照组泄殖腔拭子直接培养后呈阳性的肉仔鸡所占比例分别增加到了35%和40%，而屠宰年龄时只有4.8%的鸡直接培养呈阳性。添加丁酸的试验组，接种肠炎沙门氏杆菌后1周和3周，直接培养后泄殖腔拭子检验呈阳性的鸡只为15%，到屠宰年龄时下降到2.2%（见图1）。显著性检验表明，第9日龄（P＜0.01）、第12和27日龄（P＜0.05），两个处理间差异显著。

图1 在亮绿琼脂培养基（图1A）和预增殖后（图1B）直接接种，泄殖腔拭子呈沙门氏杆菌阳性的鸡所占比例随时间（日龄）的变化规律

对所有泄殖腔拭子呈沙门氏杆菌阳性的鸡只数目（包括正常饲养条件下阳性者）的分析表明，在20日龄（种鸡接种后15 d）时，对照组沙门氏杆菌阳性的鸡只数增加到97%，到屠宰年龄时下降到36%。而添加丁酸组，20日龄和屠宰年龄时阳性的鸡只数分别为48%和6%。自9日龄（接种后4 d）开始，两处理组阳性的鸡只数差异显著（P＜0.05）。

细菌学检验表明两组都有68%的肉仔鸡在正常饲养条件下（没有直接培养）呈沙门氏杆菌阳性。

2.3 讨论

经研究表明，无特定病原体蛋鸡感染肠炎沙门氏杆菌早期，包膜丁酸减少盲肠和内脏菌落的作用强于粉状丁酸。复合丁酸减少肝脏和脾脏菌落功效最好，其机理有待于进一步研究。由于非包膜丁酸被鸡采食后从前消化道吸收，因此其作用仅限于嗉囊，包膜丁酸则可以进入胃肠道后再释放出丁酸(Thompson等,1997)。如果没有无膜丁酸的杀菌作用，经过嗉囊后仍存活的肠炎沙门氏杆菌到达肠道后，可能会形成菌落。而包膜丁酸则能够影响肠道肠炎沙门氏杆菌菌落形成的部位。丁酸可以抑制致病基因的表达，降低肠炎沙门氏杆菌的侵袭力，从而减少盲肠细菌定植 (Porter等，1997；Lawhon等，2002；Van Immerseel等，2004b)。丁酸对肠道微生物区系组成的影响目前尚不明确。

饲料中添加丁酸可以明显减少感染肠炎沙门氏杆菌的肉仔鸡粪便中的菌落。实际上，直接培养和预增殖，菌落数目有很大不同。两组菌落定植都随时间减少。只有很少肉仔鸡到屠宰年龄时有沙门氏杆菌定植。实验中，无特定病原体蛋雏鸡饲料中添加包膜丁酸，可以减少感染早期盲肠菌落。尽管如此，到屠宰年龄时对照组和添加丁酸组菌落仍相同。因为感染早期补充丁酸组菌落定植少于对照组，盲肠菌落减少，可能会减少粪便中的排出；而且可以假设，肉仔鸡感染早期盲肠菌落也会减少。在正常饲养条件下到达屠宰年龄，两组肉仔鸡虽然没有高度定植，但是，肉仔鸡大多都表现沙门氏杆菌阳性。机体内少量沙门氏杆菌是危害公众健康的主要因素之一，因为粪样检测阴性的鸡在应激条件下细菌可能会大量定植。而且，从我们的研究和很多其他研究均发现，完全消除鸡的沙门氏菌非常困难(Berthelot-Herault等，2003；Beal等，2004；Van Immerseel等，2004c)。

3 结论

丁酸可以减少粪便中沙门氏杆菌的排出，进而减少沙门氏杆菌对环境的污染。然而，只有实施卫生检测和各种防控措施相结合，才有可能实现沙门氏杆菌的完全消除。

21篇，刊略，需者可函索）