腹主动脉缩窄大鼠模型血浆血管紧张素Ⅱ的改变

赵凌杰 焦东东 张永文 商玮 蔡辉

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是心室重塑的重要表现，是各种心血管疾病共有的进程，严重影响患者心功能甚至生活质量，肾素－血管紧张素系统(RAS)过度激活在其中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为诱导MF、心肌细胞肥大过程中的主要介质，对细胞间质胶原的沉积至关重要，其过度表达导致心肌代谢及功能异常，使其僵硬度增高，舒缩功能障碍。我们利用腹主动脉缩窄法诱导大鼠后压力超负荷所致MF模型，探讨其血浆中AngⅡ表达的改变。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 雄性SD大鼠30只，体重180～200 g，由南京军区南京总医院实验动物中心供应。饲养环境(22±2)℃，常规饲料喂养。即用型血管紧张素Ⅱ放免试剂盒购自北京海瑞生物工程公司，放免测定在南京军区南京总医院放免中心完成。

1.2 分组及模型制备 SD大鼠随机取14只作为假手术组，余为模型组。模型组根据Doering等的方法，参照其腹主动脉缩窄法，用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常规消毒，分层打开腹腔，在左肾上缘分开后腹膜等软组织，暴露腹主动脉并在双肾动脉上方分离腹主动脉，用银夹造成腹主动脉部分狭窄(银夹内径0.7mm)分层关闭腹腔。假手术组只打开腹腔、分离腹主动脉，不用银夹缩窄。

1.3 观测指标

1.3.1 左心室质量指数(LVMI):左心室与室间隔的重量(湿重)为左心室重量，用上海精科天平厂生产的JA1003型电子天平称重。左心室重量(mg)/体重(g)为LVMI(‰)。

1.3.2 左心室心肌病理形态HE染色:左心室心肌常规石腊切片采用HE染色，经过脱腊、染色、脱水、二甲苯透明及中性树胶封片等步骤，在光镜下观察左心室心肌组织病理形态改变。

1.3.3 AngⅡ放免测定:腹主动脉取血3 ml，迅速注入冰水冷却的抗凝管(10%EDTA二钠)中摇匀，即刻再放回冰水浴中冷却，4℃ 1000 r/min，离心5 min，分离血浆。血浆 －70℃保存。测定时冰冻标本在流动的冷水浴中快速融化，在冰水浴中，加样操作后，3500 r/min，离心15 min，吸弃上清，测定各管沉淀的放射性(cpm)。

1.4 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后模型组死亡6只，8周实验结束剩10只，死亡率为37.5%(6/16)。假手术组死亡2只，8周实验结束剩12只;8周死亡率14.3%(2/14)。

2.2 LVMI 腹主动脉缩窄大鼠造模8周(模型组)时LVMI为(2.91±0.32)‰较假手术组(2.10±0.12)‰显著升高(P＜0.01)。

2.3 左心室心肌病理形态HE染色 光镜下可见假手术组造模8周时左心室心同HE染色改变基本一致，心肌纤维排列整齐，心肌细胞大小、形态正常。模型组造模8周左心室心肌病理形态HE染色显示，心肌纤维排列紊乱，细胞横径增大。见图 1、2。

图1 假手术组左心室心肌造模8周时(HE×100)

图2 模型组左心室心肌造模8周时(HE×100)

2.4 血浆AngⅡ浓度的改变 造模8周时模型组血浆AngⅡ浓度为(640±220)pg/ml，较假手术组(419±76)pg/ml显著升高(P ＜0.01)。

3 讨论

AngⅡ是RAS系统的重要的生物活性肽，在多种心血管疾病发生发展中起重要作用。病理条件下，多种因素可诱导肾素释放增加，作用于血管紧张素原，使其生成10肽化合物AngⅠ;AngⅠ可在多种酶作用下转化为AngⅡ。传统多认为ACE途径是AngⅠ转化为AngⅡ的主要途径。糜蛋白酶是一种储存的惰性糜蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，Bacani等［1］认为糜蛋白酶可不依赖血管紧张素转换酶(ACE)的合成AngⅡ，这一途径脉管损伤后糜蛋白酶释放入间质立即启动，并且糜蛋白酶在间质组织中AngⅠ转化为AngⅡ方面占主要优势。糜蛋白酶尚可促进内皮素1前体的成熟［2］，进而影响心肌间质改变。此外，AngⅠ转化为AngⅡ也可经胰蛋白酶、激肽释放酶、组织蛋白酶G的作用途径完成，这一观点解释了临床血管紧张素转换酶抑制剂应用过程中出现的逃逸现象。

AngⅡ受体有AT1受体和AT2受体，AngⅡ的生理作用几乎均由AT1受体介导，如血管收缩、醛固酮分泌、儿茶酚胺释放、水钠潴留、细胞增殖等。多数试验证实AT1受体抑制剂ARB可通过阻断 RAS系统和其他旁路途径生成的AngⅡ与AT1受体结合，阻断导致MF的途径，同时增加为AngⅡ与 AT2的结合，产生扩张血管，刺激一氧化氮和前列环素的增加，并防止心肌及血管壁肥厚的作用，从而延缓心力衰竭的进程。厄贝沙坦通过阻滞AngⅡ受体，减少醛固酮分泌和交感神经的活性，改善心功能、能量代谢及毛细血管再生，抑制胶原的形成和改善MF［3］。但Varagic等［4］研究显示ARB可改善盐相关心肾的功能和结构异常而不降低血压，实验数据显示AngⅡ(通过AT1受体)可能部分参与盐负荷独立压力作用所致高血压靶器官损害。AT2受体分布较AT1广泛但目前对其功能了解不完全，大多认为可对抗AT1受体效应，如扩张血管、抑制生长、产生凋亡等。Jiang等［5］研究显示AT2受体可通过调节Ⅰ型胶原和金属蛋白酶组织抑制剂－1(TIMP1)mRNA水平影响心肌成纤维细胞的胶原代谢，从而发挥其逆转MF作用。自20世纪80年代起，人们发现除循环中的RAS外，在许多组织如心脏、血管、脑、肾等组织中也发现有肾素、Ang、ACE mRNA的表达，提示尚存在局部组织的RAS。虽然局部组织RAS各组分既可从血浆中摄取，也可在局部产生，但是局部组织的RAS生成及清除AngⅡ时，其酶学特征(底物浓度、动力学)与血浆中RAS不同。Yamamoto等［6］研究显示ACE2的缺失能促进压力超负荷诱导的心脏功能障碍，这一过程通过增加局部AngⅡ完成，说明心血管组织中的RAS在高血压、心血管重塑等的发生发展过程中起重要作用。另外，新提出的脑RAS概念包括ACE2、AngⅠ～Ⅶ、肾素原和mas受体，RAS转基因鼠肾素和血管紧张素原的过复制显示脑RAS的重要性，脑中脑肾素原生成的AngⅡ可发挥神经调节作用，可调控交感神经活性和压力反射［7］，进而影响心脏负荷甚至心肌重塑的进程。

MF是心室重塑的重要表现，是各种心血管疾病共有的进程，研究MF模型具有重要的意义。MF作为一种病理学改变，存在于高血压及心力衰竭等慢性心血管疾病模型进程中。本研究显示，造模8周时模型组左心室质量指数较假手术组显著升高(P＜0.01);左心室心肌病理形态HE染色心肌纤维排列紊乱，细胞横径增大，较假手术组变化明显，符合心肌纤维化细胞外基质改变。近来发现，CCN家族与心血管疾病有密切关系，现在普遍接受的是CCN蛋白并非生长因子，而是其他分子的修饰蛋白，尤其与细胞外基质代谢密切相关［8］。CCN蛋白参与有丝分裂、吸附、细胞程序性凋亡及细胞外基质生成、增长、停止，甚至多种细胞型的迁移。心肌细胞、成纤维细胞及细胞外基质均表达CCN1，而CCN1表达又受机械应力、缺血、缺氧刺激以及神经体液因子如AngⅡ与肾上腺素等诱导调节。目前CCN家族被认为是多种疾病新的有效治疗靶点，具有重要的临床研究意义。

本研究显示造模8周时模型组血浆AngⅡ水平较假手术组显著升高(P＜0.01)，提示大鼠腹主动脉缩窄所致心脏后负荷的高压力可能通过提高血浆AngⅡ水平而发挥促进MF的作用。这一过程中，心肌细胞和基质结构发生重塑，心肌僵硬度增高，左心室心肌中AT1受体蛋白表达水平发生改变，进一步提高AngⅡ的敏感性。AngⅡ在其中发挥重要作用，可通过TGF/Smad、NF－κB、cAMP、cGMP 及 CCN 等途径促进核内胶原mRNA表达，导致心肌中胶原沉积及比例改变，最终导致MF。因此，探讨AngⅡ及相关因子参与MF机制，对深入认识AngⅡ在心肌细胞外基质改变及心血管系统基质信号网络的调控中的作用具有重要意义。

1 Bacani C，Frishman WH.Chymase:a new pharmacologic target in cardiovascular disease.Cardiol Rev，2006，14:187－193.

2 D’Orleans Juste P，Houde M，Rae GA，et al.Endothelin－1(1－31):from chymase－dependent synthesis to cardiovascular pathologies.Vascul Pharmacol，2008，49:51－62.

3 黄岚.厄贝沙坦对老年高血压左心室肥厚的作用.医学研究生学报，2007，20:218－219.

4 Varagic J，Frohlich ED，Susic D，et al.AT1 receptor antagonism attenuates target organ effects of salt excess in SHRs without affecting pressure.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294:H853－858.

5 Jiang XY，Gao GD，Du XJ，et al.The signalling of AT2 and the influence on the collagen metabolism of AT2 receptor in adult rat cardiac fibroblasts.Acta Cardiol，2007，62:429－438.

6 Yamamoto K，Ohishi M，Katsuya T，et al.Deletion of angiotensin converting enzyme 2 accelerates pressure overload induced cardiac dysfunction by increasing local angiotensin II.Hypertension，2006，47:718－726.

7 Phillips MI，de Oliveira EM.Brain renin angiotensin in disease.J Mol Med，2008，86:715－722.

8 Yeger H，Perbal B.The CCN family of genes:a perspective on CCN biology and therapeutic potential.J Cell Commun Signal，2007，1:159－164.