小鼠结肠癌肝转移模型的构建

杨 扬* 李乃卿

随着分子生物学的深入研究，基因芯片作为基因组及后基因组时代的主要研究技术，已成为揭示药物作用机制的重要方法。基因芯片检测技术的前提是成功而适用的动物模型，首先需要获得足够的RNA检测量，所以成功的造模方法是研究课题成败的关键所在。下面就我们近期进行的结肠癌肝转移的造模方法总结如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

4～6周龄体质量20～24g的BALB/C小鼠雄性（♂）81只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：京动许字（2000）第004号总049号，在Ⅱ级动物实验室饲养。

1.1.2 瘤株

小鼠结肠癌C26细胞株（美国引进，广安门医院肿瘤实验室惠赠）。经3次皮下接种传代后，无菌条件下摘取瘤体，生理盐水洗涤，剪成小块，匀浆，离心后取沉淀，反复3次，培养于10%新生牛血清和RPMI1640培养液（含青霉素100U/mL、链霉素100U/mL），置37℃、含5%CO2培养箱中3d，每日换液。将细胞液机械吹打成单个细胞，离心取沉淀，加生理盐水调整细胞浓度为7×105/mL，观察细胞活力＞95%，备用。

1.2 方法

1.2.1 脾脏注射切脾法

随机选取39只小鼠称重，采用0.5%的戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔内注射麻醉，3～5min麻醉成功后，用胶布固定小鼠于手术台上。安尔碘皮肤消毒，左侧腋后线肋缘下纵行切口，长0.5～1cm，进腹后于腹外侧找到柳叶状脾脏，牵出腹腔外，用1mL注射器从脾下极进针，将瘤细胞液0.2mL注射于脾内，拔针后，酒精棉球按压针眼，轻轻按揉脾脏5min，使瘤细胞经脾静脉进入肝脏，注射区苍白隆起消失后，结扎脾蒂，切除脾脏，查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤关腹。术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。

1.2.2 脾脏注射保脾法

造模小鼠42只称重，采用0.5%的戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔内注射麻醉，3～5min麻醉成功后，用胶布固定小鼠于手术台上。安尔碘皮肤消毒，左侧腋后线肋缘下纵行切口，长0.5～1cm，进腹后于腹外侧找到柳叶状脾脏，牵出腹腔外，用1mL注射器从脾下极进针，将瘤细胞液0.2mL注射于脾内，拔出针头后酒精棉球压迫注射部位1～2min，查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤关腹。

造模后死亡1只，考虑失血过多致死。

2 结 果

造模后15d内自然死亡小鼠35只，切脾组21只，保脾组14只，于第12天处死小鼠23只，切脾组8只，保脾组15只，第15天将剩余小鼠22只全部处死，切脾组10只，保脾组12只。切脾小鼠自然生存期11～15d，平均（13.05±0.71）d，保脾小鼠自然生存期9～15d，平均（11.64±1.49）d。

尸检小鼠肝脏均有转移，转移率为100%。切脾小鼠肝各叶皆布满大小不一的瘤结节，大部分小鼠肝脏无正常肝组织，完全被肿瘤占据，肝重多3.5g以上，保脾小鼠脾内肿瘤巨大，肝内转移灶较少，肝脏形态、重量无明显变化，大多数为散在的米粒大小瘤结节转移，最大瘤结节为0.8×0.5cm，肝重多为0.8g左右（图1）。

3 讨 论

图1 小鼠结肠癌肝转移造模对比

结肠癌是一种常见恶性肿瘤，发病率在世界范围内为恶性肿瘤的第3位，肝脏是结肠癌常见的转移部位，15%～25%的患者在确诊已发生肝转移，20%～35%的患者转移灶仅出现在肝脏，50%～70%的晚期结肠癌患者出现肝转移。结肠癌肝转移是结肠癌患者死亡的主要原因，因此，结肠癌肝转移的治疗日益受到临床的重视。而寻找合适的动物模型可以为结肠癌肝转移的研究提供良好的实验基础。

Kozlowski等[1]提出研究肿瘤肝脏转移的最佳模式是从脾脏内植入瘤细胞，许勤等[2]同法用BALB/C小鼠脾内注射小鼠结肠腺癌细胞（CT26）造模成功率100%。左国华等[3]用BALB/C-nu/nu小鼠脾内注射人结肠癌低分化腺癌细胞株LS174T制造肝转移模型，成功率也达到100%。韩斌[4]将小鼠结肠癌细胞（CT26）悬液接种于615小鼠脾被膜下建立结肠癌肝转移模型，结果肝转移发生率为93.33%。

脾脏注射瘤细胞液造模模拟了结肠癌根治术后血行转移肝脏的途径和过程，造模成功率高。脾脏注射后保脾小鼠肝转移率为100%，但是，肿瘤多为散在的瘤结节，数目较小、体积较小，可能无法满足较大组织量的检测要求。同时，由于脾内肿瘤较大，小鼠常较早死于脾内肿瘤，无法满足多个时间点检测的需要。脾脏注射瘤细胞液切脾法则可获得转移肿瘤组织较多，能满足各种检测方法取材的需要，尤其是基因芯片检测取材需近500mg组织，且小鼠生存时间较保脾组长，可以满足多个时间点的取材。另外，在切断脾蒂前将脾脏完全暴露，便于进针注射及结扎、切断脾蒂，避免了脾脏大出血，减少动物造模的死亡率。

因此，小鼠结肠癌肝转移模型的建立以脾脏注射瘤细胞液后切脾法最佳，尤其适用于结肠癌肝转移的基因组表达谱研究，可同时满足检测组织量及选取多个时间点的要求。

[1] Kozlowski JM,Fidler IJ,Campbell DE,et al.Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse[J] .Cancer Res,1984,44(8):3522-3529.

[2] 许勤,吴文溪,马利民,等.小鼠结肠腺癌肝转移模型的建立[J] .实用癌症杂志,2000,15(5):456-457.

[3] 左国华,葛海燕.人结肠癌裸小鼠肝转移模型的建立[J] .中华实验外科杂志,1999,16(4):373.

[4] 韩斌.615小鼠结肠癌肝转移模型的建立[J] .医药论坛杂志,2005,26(23):26-27.