黄皮洋葱寡糖提取工艺的研究

田 园，史美丽，刘锦梅

(青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109)

寡糖是由2～10个单糖通过糖苷键连接形成的直链或支链的低度聚合糖，有功能性寡糖和普通寡糖之分。功能性寡糖具有独特的生理活性，能显著改善脂质、降低血清胆固醇、提高人体免疫力、分解致癌物、促进肠道蠕动、防止便秘[1]。天然植物中含有未曾发现和认知的新型寡糖，因此筛选含有寡糖的天然植物以及进行天然寡糖的提取分离等研究对生命科学的发展具有一定的学术意义。

洋葱(AlliumcepaL.)，别名玉葱，为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)植物[2]，其活性成分洋葱寡糖可提高机体免疫力，激活巨噬细胞的吞噬活性，对预防、抑制和杀死肿瘤细胞有重要作用[3]。在饲料中添加适量洋葱寡糖，可显著提高肉鸡的日增重、降低肉鸡大肠粪便中NH3-N含量[4]。作者以黄皮洋葱为原料提取洋葱寡糖，优化了洋葱寡糖提取及分离纯化工艺，以期为洋葱寡糖结构表征和生理活性研究奠定基础。

1 实验

1.1 原料、试剂与仪器

黄皮洋葱，市售。

正丁醇、氯仿、无水乙醇，分析纯，莱阳市康德化工有限公司；蒽酮，分析纯，上海市五联化工厂；活性炭，珠海市怀玉山活性炭科技有限公司；Sephadex G-25，上海蓝季科技发展有限公司；葡萄糖，分析纯，天津市北方天医化学试剂厂； 考马斯亮蓝G250，分析纯，上海如吉生物技术有限公司。

DF-Ⅱ型集热式恒温磁力搅拌器，江苏省金坛市恒丰仪器厂；752型紫外分光光度计、AR2140型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；DBS-100型电脑全自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司；B-260型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；S21-4型恒温水浴锅，上海悦丰仪器仪表有限公司；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；干燥烘箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料含水量及寡糖含量的测定

分别称取新鲜洋葱33.1200 g、23.5600 g、15.6100 g，置于50℃烘箱中干燥至恒重，计算平均含水量(以总质量计，下同)。

精确称取洋葱50.0000 g，组织破碎匀浆，用4 BV的95%乙醇洗涤(除去可溶性单糖)，抽滤，滤渣重复洗涤2次，加水，在料液比为1∶4(g∶mL，下同)、提取温度为70℃、提取时间为90 min的条件下提取得到洋葱寡糖液，重复提取3次，合并提取液，旋蒸浓缩，浓缩液加水溶解定容至250 mL，取1 mL溶液，采用蒽酮-硫酸比色法测定寡糖含量。平行测定3次。

1.2.2 标准曲线的绘制[5]

精确称取干燥至恒重的葡萄糖50.00 mg置于50 mL容量瓶中，加纯净水溶解，定容至刻度，摇匀，即得1.0 g·L-1葡萄糖标准溶液。

精确移取葡萄糖标准溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、8 mL、10 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加水至刻度。分别取上述溶液1.0 mL置10 mL具塞试管中，加入0.2%蒽酮试剂4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷却，然后放入热水浴中，具塞，煮沸10 min，自来水冷却。室温放置10 min，以试剂空白为参比，用紫外分光光度计在620 nm波长处测定吸光度。以糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 葡萄糖的标准曲线

1.2.3 洋葱寡糖提取单因素实验

精确称取50 g洋葱，组织破碎匀浆，以提取溶剂、提取次数、料液比、提取时间、提取温度为单因素变量提取洋葱寡糖，提取液旋蒸浓缩，浓缩液醇沉，离心、干燥，得粗寡糖；粗寡糖水溶，定容至250 mL；取1 mL，采用蒽酮-硫酸比色法测定寡糖含量，考察各单因素对寡糖提取率的影响。

1.2.4 洋葱寡糖提取正交实验

以水为提取溶剂，以寡糖提取率为考察指标，选择料液比 、提取时间、提取温度为考察因素，采用L9(34)正交实验优化提取工艺。正交实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素及水平

1.2.5 洋葱寡糖的分离纯化

采用活性炭脱色法处理寡糖提取液。以紫外可见分光光度计在570 nm处测定寡糖提取液脱色前后吸光度，按下式计算脱色率。

同时用蒽酮-硫酸比色法测定脱色前后寡糖的含量，计算寡糖回收率。确定最佳脱色工艺。

式中：M前、M后分别为脱色前后的寡糖含量。

脱色后的溶液采用Sevag法脱蛋白。加入体积分数为20%的Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇= 4∶1)，混合，振荡，蛋白质及有机相从分液漏斗下部除去。采用考马斯亮蓝比色法[6]测定溶液中蛋白质的含量，以脱蛋白次数为变量，测定3、4、5次操作后溶液中蛋白质的含量。

1.2.6 凝胶色谱法纯化、分级制备寡糖纯品[7]

色谱条件：葡聚糖凝胶Sephadex G-25，色谱柱长80 cm、直径1.5 cm，流动相为0.05 mol·L-1氯化钠溶液，进样量 10 mL，流速0.3 mL·min-1，以DBS-100电脑全自动部分收集器收集。

寡糖提取液经活性炭脱色、Sevag法脱蛋白、5 BV 95%的乙醇沉淀、冷冻干燥后以水溶解，进行凝胶柱层析。收集液以蒽酮-硫酸比色法确定寡糖的部位，合并寡糖部位收集液，浓缩醇沉，离心，冷冻干燥，计算寡糖回收率，用蒽酮-硫酸比色法测定产品纯度。

1.2.7 提取样品中寡糖含量的测定

取1 mL样品提取液置于100 mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，取1 mL置10 mL具塞试管中，加入0.2%蒽酮试剂4.0 mL，冰水浴冷却，具塞煮沸10 min，自来水冷却。室温放置10 min，以试剂空白为参比，在620 nm波长处测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 新鲜黄皮洋葱含水量及寡糖含量

经测定，新鲜黄皮洋葱含水量为90.75%、寡糖含量为4.09%。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 溶剂的选择

寡糖是极性分子，可采用极性溶剂水或强极性的盐溶液作提取溶剂。将50 g洋葱匀浆液在料液比为1∶4、提取时间为90 min、提取温度为70℃的条件下，以不同的溶剂(0.8 mol·L-1盐水溶液)进行提取，考察其对洋葱寡糖提取率的影响，结果见图2。

图2 溶剂对寡糖提取率的影响

由图2可知，溶剂对提取率的影响不大，强极性的盐溶液和水作溶剂时，寡糖的提取率基本相当，说明水的极性已能满足完全提取寡糖的要求。故确定洋葱寡糖的提取溶剂为水。

2.2.2 提取次数的确定

以水为溶剂，将50 g洋葱匀浆液在料液比为1∶4、提取时间为90 min、提取温度为70℃的条件下进行提取，考察提取次数对寡糖提取率的影响，结果见表2。

表2 浸提次数对寡糖提取率的影响

由表2可知，提取2次时寡糖提取率为5.65%，提取基本完全。因此，确定提取次数为2次。

2.2.3 料液比的影响

以水为溶剂，将50 g洋葱匀浆液在提取温度为70℃、提取时间为60 min的条件下重复提取2次，考察料液比对寡糖提取率的影响，结果见图3。

图3 料液比对寡糖提取率的影响

由图3可知，随溶剂用量的增大，寡糖的提取率不断上升；当料液比达到1∶4后，提取率趋于稳定。这是因为，溶剂用量较小时，寡糖溶解不完全；随着溶剂用量的增加，寡糖溶解浸出量增大；当溶剂用量足够溶解所有寡糖时，继续增加溶剂用量，提取率变化不大。故选择料液比为1∶(3～5)进行正交优化实验。

2.2.4 提取时间的影响

以水为溶剂，将50 g洋葱匀浆液在提取温度为70℃、料液比为1∶4的条件下重复提取2次，考察提取时间对寡糖提取率的影响，结果见图4。

图4 提取时间对寡糖提取率的影响

由图4可知，提取时间越长，寡糖提取率越高；提取90 min时提取率达到最大；之后提取率随时间的延长而下降。提取过程非常复杂，融合浸泡、扩散、渗透、溶解、再扩散、平衡等步骤，需要较长的时间，但提取时间过长，会造成提取液中部分寡糖分解，导致提取率下降。故选择提取时间为70～90 min进行正交优化实验。

2.2.5 提取温度的影响

以水为溶剂，将50 g洋葱匀浆液在提取时间为60 min、料液比为1∶4的条件下重复提取2次，考察提取温度对寡糖提取率的影响，结果见图5。

图5 提取温度对寡糖提取率的影响

由图5可知，寡糖提取率随提取温度的升高而上升；提取温度为60℃时提取率达到最大；提取温度高于60℃时，提取率反而降低。这是因为提取温度过高，会导致溶液中寡糖对热的不稳定性而分解。故选择提取温度为50～70℃进行正交优化实验。

2.3 正交实验结果与分析(表3)

由表3可知，各因素对洋葱寡糖提取率的影响大小依次为B>C>A，最佳提取工艺条件是A2B2C3，即料液比1∶4 、提取时间80 min、提取温度70℃，此时，洋葱寡糖的提取率达70.19%。

2.4 洋葱寡糖的分离纯化

2.4.1 活性炭脱色

表3 正交实验结果与分析

实验发现，当活性炭添加量(活性炭/提取液)为2.5 g·L-1、脱色时间为20 min、脱色温度为70℃时，脱色率为85.48%、寡糖回收率为85.13%。

2.4.2 Sevag法脱蛋白

实验发现，经3、4、5次Sevag法脱蛋白后，寡糖提取液的蛋白质含量由18.763 μg·mL-1分别降至9.246 μg·mL-1、1.269 μg·mL-1、0.997 μg·mL-1，表明经4次Sevag法处理，即可完全去除蛋白质。

2.5 凝胶色谱法制备寡糖纯品(图6)

由图6可以看出，洋葱寡糖在50～100 mL之间有单一对称洗脱峰，寡糖的回收率为71.35%、纯度为99.61%。

3 结论

(1)单因素实验和正交实验表明，以水为溶剂提取洋葱寡糖时，各因素对寡糖提取率影响大小依次为：提取时间>提取温度>料液比。优化的提取工艺条件为：料液比 1∶4(g∶mL)、提取温度70℃、提取时间80min。在此条件下提取2次，寡糖提取率为70.19%。

图6 Sephadex G-25柱层析

(2) 采用活性炭脱色，当活性炭用量(活性炭/提取液)为2.5 g·L-1、脱色时间为20 min、脱色温度为70℃时，脱色率为85.48%、寡糖回收率为85.13%。经4次Sevag法处理可完全去除蛋白质。5 BV的95%乙醇可使寡糖沉淀完全。

(3) 经葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析纯化分级，寡糖回收率为71.35%、纯度为99.61%。

[1] 汪世华，彭利民，张会，等.低聚果糖的开发与应用[J].中国乳品工业，2002，30(2)：31-34.

[2] 冯长根，吴悟贤，刘霞，等.洋葱的化学成分及药理作用研究进展[J].中国中医药杂志，2003，37(7)：63-65.

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[5] 刘云.当归多糖的提取及含量测定[J].现代中药研究与实践，2003，17(1)： 49-53.

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