豚鼠迷路震荡造模初探△

徐鸥 李志玉 刘砚星 张燕卓 路虹

豚鼠迷路震荡造模初探△

徐鸥1李志玉1刘砚星2张燕卓1路虹1

目的 借助自制单摆打击装置建立脑震荡动物模型，探讨迷路震荡动物模型的建立方法。方法 将40只健康豚鼠随机分为对照组、撞击后4周组、撞击后6周组和撞击后8周组，每组10只。在清醒状态下以自制的单摆打击装置对实验组动物头部实施一次性打击，对照组不予打击。实验前后测试动物双耳DPOAE和ABR。测试结束后断头处死动物，取出耳蜗制作光镜和透射电镜标本，观察各组动物耳蜗螺旋器和螺旋神经节的病理改变；实验各组随机抽取2只动物行脑组织切片，HE染色，观察脑神经细胞形态。结果 实验组动物头部受打击后无颅骨骨折，脑组织病理切片可见神经细胞肿胀和轴索断裂；与正常对照组比较，撞击后4周组DPOAE在0.5、0.7、1、2 k Hz幅值降低；撞击后6周组仅2 k Hz幅值降低，撞击后8周组仅1、2 k Hz幅值降低（均P＜0.05）；各实验组与正常对照组比较ABR反应阈降低（P＜0.05）。撞击后4周组和6周组螺旋器隧道变形，毛细胞排列不整齐，撞击后8周组螺旋器及毛细胞未见明显变化；透射电镜发现实验各组螺旋神经节细胞均有不同程度受损。结论自制单摆打击装置可成功建立脑震荡动物模型；动物脑震荡后听力及耳蜗毛细胞功能及螺旋神经节病理变化符合迷路震荡特点；脑震荡动物模型可适用于制作迷路震荡动物模型。

豚鼠； 迷路震荡； 动物模型； 耳蜗； 螺旋神经节

脑震荡尤其是迷路震荡（labyrinthine concussion）所致听力障碍一直是法医学鉴定的难点之一。以往关于迷路震荡的报道仅涉及迷路震荡的临床特点和治疗方法，而有关迷路震荡动物模型的建立及其发生机制鲜见报道。本实验借助脑震荡动物模型，观察动物脑震荡后的听功能改变及内耳病理变化，以期证实脑震荡同时常伴有迷路震荡，即脑震荡动物模型可同样适用于制作迷路震荡动物模型，从而为临床研究迷路震荡发生机制提供实验依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用40只健康白毛红目豚鼠，体重250～400 g，雌雄不限（由河北医科大学实验动物中心提供），随机分为正常对照组、撞击后4周组、撞击后6周组、撞击后8周组，每组10只。

1.2 实验仪器和设备 美国产Smart OAE4.41USBZDP－OAE型耳声发射系统；日本三荣7S－12型诱发电位仪；尼康数码光镜照相机；日本电子公司JEM－1230型透射电镜。

1.3 自制单摆打击装置及脑震荡动物模型的建立

参照刘迎春等［1］方法制作单摆打击装置。以木条制成一框，长50 cm，宽50 cm，高70 cm，在框后侧钉一木板，木板下部固定一泡沫软垫。在框上方距后侧12 cm处与之平行钉一木条，木条中点下面固定一铁环，用于悬挂冲击锤和线套。线套供挂钩动物上门牙之用，钩挂后可使动物头部充分后仰，其下颌骨及颈部面向框后木板，顶枕部暴露于后。在木框两侧框条上，以水平方向向后伸出一V型铅丝，其尖端正好位于冲击锤落下后垂直的位置上，以阻挡其继续向前摆动，避免动物头部被挤压在铅锤与软垫之间造成严重挤压伤。摆锤是用铅做成的直径4 cm，长8 cm的圆柱体，质量1.136 kg，中间凿一环形浅沟，连接摆杆，摆杆长为50 cm。在木板中央，线套与摆杆构成的直线处，置一光滑轨道，以避免偏位打击，角度刻度盘用以测量摆角。

为模拟临床脑震荡发生情况，豚鼠处于清醒状态，安静温顺，门齿勾于线圈上，助手帮助摆正其头部，使之在前后方向上处于自由状态且在摆锤落下时正好打在两耳中间的顶枕部。摆锤以90°角的高度零初速度自由落下1次，即可对豚鼠头部造成损伤（图1）。实验组各组动物均分别完成一次性头部打击，正常对照组不实施打击。

图1 自制单摆打击装置

图2 脑震荡动物模型造模后豚鼠受外力打击脑组织病理切片

1.4 临床症状观察及脑组织病理学检查 打击后立刻观察豚鼠的意识状态、行为、呼吸和心跳，并立即从每组中随机选取2只动物，以3%戊巴比妥钠40 mg／kg麻醉后以4%多聚甲醛心脏灌注，取脑组织切片，HE染色，观察脑组织病理变化。

1.5 听功能检查及耳蜗形态学观察 实验前后测试动物双耳DPOAE和ABR，测试结束后断头处死动物，取出耳蜗制作光镜和透射电镜标本。

1.5.1 DPOAE测试 豚鼠置于电声和磁场的屏蔽室内，2%戊巴比妥钠40 mg／kg腹腔注射麻醉后，将耳声发射系统的声源与接收器导入外耳道，两纯音的固定频比为f2／f1＝1.2；刺激声强度为：L1＝ 65 dB SPL，L2＝55 d B SPL；频率范围：以（F1（F2）1／2＝0.5、0.7、1、1.4、2、3、4、6、8 k Hz 9个频率点处进行测试，叠加200次，以高于本底噪声3 dB为反应出现的确认标准。

1.5.2 ABR测试 动物麻醉后将银盘电极分别置于颅顶正中、鼻背处及双耳廓，采用Click短声刺激，强度从90 d B SPL开始，降至反应波消失，以波III判定反应阈值，每次测试均重复两次确定。

1.5.3 形态学观察 每组动物DPOAE与ABR测试完毕后，以断头法处死取出听泡，暴露耳蜗，蜗尖钻孔，取出镫骨，挑破圆窗膜与蜗窗膜，进行耳蜗灌注。每组选取5只用于光镜标本制作，3只用于透射电镜标本制作。

1.5.3.1 光镜标本制作 用4%多聚甲醛（4oC，p H＝7.4）缓慢灌流耳蜗5遍，置于固定液4～6小时后，用0.1mol／L磷酸缓冲液清洗，10%EDTA脱钙20天，石蜡包埋，平行蜗轴连续切片，苏木精－伊红染色，光镜观察。

1.5.3.2 透射电镜观察 用4%戊二醛（4oC，p H＝7.4）约5 ml，缓慢灌流耳蜗5遍，置于固定液4～6小时，10%EDTA脱钙10～15天，磷酸缓冲液漂洗，解剖显微镜下切取各回基底膜，1%四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片染色，透射电镜观察。

1.6 统计学方法 全部实验数据均应用SPSS 13.0统计软件进行处理，四组间比较用Dunnett t检验。

2 结果

2.1 临床症状及脑组织病理 撞击即刻豚鼠四肢松软，5 s后出现痉挛或惊厥状态，5～10 min后出现昏迷，角膜反射消失至少10 s，呼吸暂停，心跳减慢＜60%或心跳加速＞10%，约3～4分钟后清醒，完全符合脑震荡的临床表现［1］。动物完全清醒后表现出行动迟缓，步态不稳，精神差。脑组织解剖过程中未见颞骨骨折，病理切片检查可见神经细胞水肿和轴索断裂，且无出血（图2），符合脑震荡病理改变［］。

2.2 DPOAE测试结果 与正常对照组比较，撞击后4周组0.7、1、2 k Hz DPOAE幅值降低；撞击后6周组仅2 k Hz DPOAE幅值降低；撞击后8周组仅1、2 k Hz DPOAE幅值降低（均为P＜0.05）（表1）。

表1 对照组及各实验组DPOAE各频率幅值

表1 对照组及各实验组DPOAE各频率幅值

注：▼与正常对照组比较，P＜0.05；●与撞击后4周组比较，P＜0.05

频率（k Hz）0.5 0.7 1 1.4 2 3 4 6 8正常对照组10 5.90±5.84 5.50±0.10 2.39±4.06－13.20±9.45－9.50±15.03－11.80±11.25－11.30±2.91 4.40组别例数（只）.26 ±9.62 12.20±9.16撞击后4周组8 6.10±9.16 1.36±0.16▼－1.70±7.24▼－7.60±3.50－12.00±9.76▼－12.00±9.42－10.10±4.36 2.90±5.78 8.50±5.87撞击后6周组8 6.20±6.21 1.31±0.11●7.80±6.09●－12.50±10.70－17.70±9.84▼－17.30±8.45－10.60±4.53 9.20±7.84 17.60±13.09撞击后8周组8 5.40±6.38 1.21±0.06 2.40±6.87▼●－8.70±10.23－8.70±10.23▼－12.60±14.42－6.80±4.02 7.00±6.25 10.50±13

2.3 ABR阈值 正常对照组ABR反应阈为13.50±5.30 d B SPL，撞击后4、6、8周组分别为25.0 ±3.33、19.0±3.16、18.0±3.50 d B SPL。经Dunnett t检验，各实验组与正常对照组相比较，阈值升高（均为P＜0.05）；撞击后6、8周组较撞击后4周组阈值降低（P＜0.05），但撞击后6周组和撞击后8周组阈值比较无明显差异（P＞0.05）。

2.4 光镜观察 正常豚鼠耳蜗可见螺旋器隧道正常，外毛细胞排列整齐，刷状缘清晰（图3a）；撞击后4周组，螺旋器隧道增宽变形，毛细胞排列不整齐，刷状缘不清晰（图3b）；撞击后6周组，螺旋器隧道挤压变形，毛细胞排列欠整齐（图3c）；撞击后8周组，螺旋器及毛细胞未见明显变化（图3d）。

图3 各组耳蜗光镜观察图像

图4 各组耳蜗透射电镜观察图像

2.5 透射电镜观察 正常螺旋神经节细胞核圆、核仁居中，线粒体无肿胀，内质网均匀分布，溶酶体无肿胀溶解（图4a）。撞击后4周组螺旋神经节细胞内质网扩张，线粒体肿胀，空泡样变（图4b）；撞击后6周组螺旋神经节细胞线粒体嵴个别消失，线粒体肿胀（图4c）；撞击后8周组线粒体肿胀，嵴位于周边（图4d）。

3 讨论

迷路震荡（labyrinth concussion）是指内耳膜迷路在受到声波频率以下的刺激后而出现的震荡性损伤。震荡频率一般为10～20次／秒，常与脑震荡同时存在，多不伴有颞骨骨折。其病因多为头颅外伤，如坠落伤、枕部或颞骨受到机械重击，也可因强力爆炸所致的空气振动冲击波等。头部闭合性损伤时，造成脑脊液循环障碍，引起脑脊液压力骤升，压力可通过导水管或内听道向外传至内耳，使外淋巴压力骤升，从而造成迷路损伤，患者伤后除有脑震荡的症状外，部分患者伴有耳鸣、耳聋等［2］。有学者报道脑震荡后遗留听功能障碍患者占脑震荡后遗症的23.2%，仅次于头晕、头痛，其病理呈现耳蜗微毛细血管循环障碍、突触损伤等［3～5］。诊断并不困难，只是在头颅外伤后有脑震荡时迷路震荡常被忽略，患者多在脑震荡缓解后才就诊于耳鼻喉科。

本实验采用单摆装置打击清醒状态下的豚鼠制作脑震荡模型，制作方法简单，操作简便易行，接近人的受伤状态。本实验中，实验组豚鼠ABR反应阈在脑震荡后第四周达到最高，此后有所恢复，但始终未恢复到打击前水平，说明在此实验中迷路震荡对听觉系统造成了不可逆的损害。DPOAE主要反映外毛细胞的功能状态，本实验观察发现脑震荡后豚鼠DPOAE幅值以1、2 k Hz升高为主，说明迷路震荡主要影响此频率段外毛细胞的功能。此外，文献报导迷路震荡伤后一定程度的听力障碍不仅与耳蜗Corti器受损有关，还与螺旋神经节细胞的病理改变有联系［6，7］。从文中结果看，实验组中撞击后4周组和撞击后6周组豚鼠耳蜗毛细胞排列不整齐螺旋器隧道变形，螺旋神经节细胞发生了内质网扩张，线粒体肿胀及空泡样变等病理改变，与文献相符。

根据实验动物一般表现以及听力学测试结果，说明动物脑震荡的同时伴发了迷路震荡，说明该自制单摆打击装置同样适用于制作迷路震荡动物模型。

1 刘迎春，石秋念.实验性脑震荡脑组织形态学改变的动态观察［J］.浙江医科大学学报，1996，25：193.

2 高文元，迟放鲁，贺秉坤，等.临床听觉生理学［M］.北京：人民军医出版社，2004.154～485.

3 Couch JR，Bearss C.Chronic daily headache in the post－trauma syndrome：relation to extent of head injury［J］.Headache，2001，41：559.

4 Korinthenberg R，Schreck J，Weser J，et al.Post－traumatic syndrome after minor head injury cannot be predicted by neurological investigations［J］.Brain Dev，2004，26：113.

5 肖兴义，尹小梅，薛关生.脑震荡后脑功能障碍与相关因素回顾性研究［J］.现代康复，2001，5：20.

6 王文利，路虹，张颖，等.脑震荡前后大鼠听力及耳蜗形态变化［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，14：531.

7 路虹，李志玉，韩海霞，等.豚鼠脑震荡后耳蜗功能及螺旋神经节细胞的病理变化研究［J］.中华耳科学杂志，2008，6：345.

（2010－04－13收稿）

（本文编辑 李翠娥）

Labyrinthine Concussion ModeIExpIoration

Xu Ou*，Li Zhiyu，Liu Yanxing，Zhang Yanzhuo，Lu Hong
（*Department of OtoIaryngoIogy，the Second HospitaI of Hebei MedicaI University，Shijiazhuang，Hebei，050000，China）

Objective To establish a labyrinthine concussion model by using self－made pendulum shocking model of cerebral concussion.Methods Forty healthy guinea pigs were randomly divided into 4 groups，10 animals per group：normal control group；four weeks post－concussion group；six weeks post－concussion group；eight weeks post－concussion group.The disposable attack was implemented by the self－made pendulum shocking device to the experimental group animals forehead under the coaking condition，while the control group did not receive the same attack.Before and after the treatment，animal binaural distortion product otoacoustic emissions（DPOAE）and auditory brainstem response（ABR）were tested.One day after the experiment test，the animals were decapitated.Otic vesicles were removed immediately，and the cochleas were fixed with different fixatives.The specimens were prepared for light microscopy（LM）and transmission electron microscopy（TEM）.Pathology change of animal cochlea spiral organ and the spiral ganglion in each group were observed.Of 2 animals in each group were randomly selectcd for brain tissue slice，hematoxylin－eosin（HE）dyes，and cerebral nerve cellular morphology observation.After the experimental animals＇forehead were attacked，skull fracture did not happen.Nerve cell swelling and the axis cylinder broken were observed on brain pathological speciments.ResuIts The DPOAE amplitude at 0.5 k Hz，0.7 k Hz，1 k Hz and 2 k Hz in the four weeks post－concussion group were lower than those of normal control group（P＜0.05），the amplitude at 2 k Hz in the six weeks post－concussion group was lower than that of normal control group（P＜0.05），the amplitude at 1 k Hz and 2 k Hz in the eight weeks post－concussion group were lower than those of normal control group（P＜0.05）.The ABR thresholds in all experiment groups were significantly changedthan that of control group（P＜0.05）.The structure of Corti＇s organ was damaged severely in four weeks postconcussion group and six weeks post－concussion group.The line of hair cells was in irregular.While there was no obvious change in eight weeks post－concussion group.The cellular organs of spiral ganglion cells（SGCs）were injured severely in experiment groups.ConcIusion The cerebral concussion model can be established by using selfmade pendulum shocking device.The auditory disfunction and pathological changes occurred in cochlea in guinea pigs with cerebral concussion，which were conformed to labyrinthine concussion characteristic.Thus cerebral concussion model could be used as labyrinthine concussion model.

Guniea pig； Labyrinthine concussion； Animal model； Cochlea； Spiral ganglion

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.013

R764.34

A

1006－7299（2010）04－0355－04

△ 河北省科技支撑计划项目（08276101D－35）

1 河北医科大学第二医院耳鼻喉科（石家庄 050000）； 2 河北医科大学药理教研室作者简介：徐鸥，女，主治医师，硕士，主要从事内耳疾病方面研究

路虹（Email：Luhong12112003＠yahoo.com.cn）