耳鸣模型大鼠听皮层生长相关蛋白－43和细胞骨架活性调节蛋白的表达*

苏文玲 赵德安 高兴强 刘庆华 魏婷婷 赵岩

耳鸣模型大鼠听皮层生长相关蛋白－43和细胞骨架活性调节蛋白的表达*

苏文玲1赵德安1高兴强1刘庆华1魏婷婷1赵岩2

目的 检测神经元功能可塑性基因生长相关蛋白－43（growth associated protein，GAP－43）和细胞骨架活性调节蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein，ARC）在水杨酸诱导耳鸣大鼠听皮层中的表达，探讨其在耳鸣产生中的作用。方法 将24只白色Wistar大鼠随机分为3组：水杨酸钠组（8只）、生理盐水组（8只）和空白对照组（8只）。前两组从条件反射建立前开始于每次条件反射训练前2小时分别腹腔注射10%水杨酸钠溶液（350 mg／kg）和同体积生理盐水，至实验结束，空白对照组不做任何处理。通过行为学方法证实水杨酸钠组动物感受到耳鸣后，利用荧光定量PCR检测动物听皮层中GAP－43和ARC的表达。结果 水杨酸钠组大鼠听皮层中GAP－43和ARC蛋白阳性神经元的表达（分别为2.17±0.72、4.90±2.13）明显高于生理盐水组（分别为1.05±0.20、1.13±0.42）和空白对照组（分别为0.96±0.97、1.07±0.70）（P＜0.01），而生理盐水组和空白对照比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 耳鸣大鼠听皮层中神经元功能可塑性基因GAP－43和ARC蛋白阳性神经元的表达增加，推测它们可能在耳鸣的发生发展中起重要作用。

耳鸣； 基因，ARC，GAP－43； 听皮层； 水杨酸钠

新近的研究认为，耳鸣动物听皮层中可能发生了功能性重组［1］。细胞骨架活性调节蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein，ARC）可以改变神经元的兴奋性和可塑性，并且是听觉系统变化的标志之一。生长相关蛋白－43（growth associated protein－43，GAP－43）又名B－50、F1、PP46、神经调节素，是一种胞膜磷酸蛋白质，体外培养脊髓神经元的结果表明，GAP－43的表达与神经元轴突生长一致［2］。在发育成熟的中枢神经系统中，成熟神经元轴突的生长和突触的可塑性处于抑制状态，当轴突受到损伤后，轴突的延长和重建可被重新诱导，诱导神经轴突向外生长依赖于有关蛋白的合成，GAP－43就是表达明显的蛋白之一，GAP－43的表达是评估轴突损伤和再生反应的重要指标［2］。因此，GAP－43和ARC的表达水平能够反映中枢神经系统功能活动的变化，被普遍认为与中枢神经系统的功能可塑性有关。本研究通过对GAP－43和ARC基因在耳鸣动物模型大鼠听皮层中的表达进行研究，旨在探讨耳鸣大鼠听皮层发生的可塑性变化及其在耳鸣产生中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用2～3月龄、健康、耳廓反应灵敏、无中耳感染、双耳ABR反应阈在20～30 dB SPL、体重200～300 g的Wistar大鼠24只（厦门大学实验动物中心提供），雌雄不限。所有实验动物均无强噪声暴露及耳毒性药物使用史。适应性喂养1周后随机（用纸袋抽签）分为3组，每组8只：①水杨酸钠组，从条件反射建立前开始于每次条件反射训练前2小时腹腔注射10%水杨酸钠溶液（350 mg／kg），至实验结束，制造耳鸣动物模型；②生理盐水组，每天在相同时间段内腹腔注射同体积生理盐水；③空白对照组，生活于安静环境中不限水、不注射药物。水杨酸钠组和生理盐水组按照耳鸣行为学模型建立的需要，给予白噪声刺激及条件反射训练，注射药物的持续时间根据条件反射训练的结果而定，约10～14 d。

1.2 耳鸣动物模型的确立 参照李明［3］等创立的耳鸣动物模型的方法，将限制进食的动物置于有背景白噪声的隔声室内进行条件反射训练，使动物将耳内声音的有无与安全与否联系起来，形成“背景噪声停止—进食减少或停止”的条件反射。用条件反射消退期的长短来证明动物是否感受到耳鸣，即如果动物感受到了耳鸣，那么在背景噪声停止后动物会把耳鸣当成部分安全信号，从而加快条件反射的消退。本实验三组大鼠均成功建立了条件反射，水杨酸钠组条件反射平均消退期为3.00±1.07天，生理盐水组消退期为4.50±1.19天，空白对照组消退期为6.25±1.04天，经单向方差分析，各组差异均有统计学差异，说明注射水杨酸钠后大鼠确实感受到了耳鸣。

1.3 取材及荧光定量PCR测定

1.3.1 切取听觉通路核团双侧听皮层 最后1次注射药物后3 h将大鼠置于封闭的装有乙醚的干燥器内麻醉后，于近枕骨处迅速断头，分离颅骨皮肤，暴露枕骨大孔，用剪刀经枕骨大孔延颅中线将颅骨剪开，掀开颅顶两侧颅骨后，再分离左右两侧颅骨，即可完整暴露大鼠脑组织。最后离断入颅神经，游离出脑组织。根据大鼠脑立体定位图谱切取含听皮层的脑组织，并浸于存有RNAstore样本保存液的EP管中。将标本当天在4℃条件下过夜渗透，第二天转存于－80℃保存。

1.3.2 荧光定量－PCR测定

1.3.2.1 引物与探针的设计与合成 所有引物根据Genbank的登录号，查找m RNA序列，利用NCBI primer designing tool工具在线设计，由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物与探针的设计与合成

1.3.2.2 RNA完整性和纯度鉴定 利用试剂盒提取总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，从图谱上可见18S和28S两条清晰条带（图1），说明总RNA完整性较好。以紫外分光光度法检测其在260、280 nm的吸光度值，计算OD260／OD280的比值鉴定RNA纯度，所有样品的OD260／OD280比值均在1.7～2.0之间，说明纯度较高，完全能够满足后续实验研究需要。

1.3.2.3 样品处理、紫外分光光度法测定提取RNA的含量，采有TAKARA试剂盒进行反转录及RT－PCR等，详细步骤严格按照说明书进行。

1.4 结果判断与统计学方法 本实验采用相对定量分析基因表达情况，采用GAPDH作为管家基因，基因表达结果以靶标基因与管家基因的比值表示。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线分析，确定引物扩增特异性和扩增效率。所有数据用SPSS13.0统计软件包统计，各组动物听皮层中GAP－43和ARC荧光定量PCR的表达，均数间的两两比较采用最小显著性t检验。

图1 总RNA电泳图

2 结果

2.1 本实验以GAPDH作为管家基因进行基因相对定量表达分析 GAPDH、ARC和GAP－43三者的溶解曲线和扩增曲线都是单一的峰，说明引物扩增的特异性非常好。

2.2 各组大鼠听皮层中GAP－43和ARC表达结果见表2，可见，水杨酸钠组大鼠听皮层中GAP－43和ARC蛋白阳性神经元的表达明显高于生理盐水组和空白对照组（P＜0.01），而生理盐水组和空白对照比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠GAP－43和ARC荧光定量PCR表达

表2 各组大鼠GAP－43和ARC荧光定量PCR表达

注：*与其他两组比较，P＜0.01

GAP－43 ARC水杨酸钠组8 2.17±0.72*4.90±2.13组别n * 8 0.96±0.97 1.07±0.70生理盐水组8 1.05±0.20 1.13±0.42空白对照组

3 讨论

3.1 耳鸣和听皮层可塑性的关系 以往认为，耳鸣的病变部位主要位于听系末梢器官，实际上，不论耳鸣产生于外周还是中枢，异常信号必须上传到大脑皮层才能被感知为耳鸣，即听觉中枢特别是大脑皮层参与了耳鸣的产生与维持［1］。近来脑功能成像研究证明，耳鸣患者的颞叶听皮层存在高代谢活动或局部脑血流增加，提示大脑皮层可能有异常的改变［1］。耳鸣的感觉会增加听皮层的活动，对水杨酸钠注射后大鼠大脑的扫描发现，中枢听觉通路的活动性发生了改变，与对照组比较，在脑干和中脑活动性水平减少，而听觉皮层的活动性增加。这种兴奋性的持续存在，可能导致听皮层神经元发生改变［4］。

3.2 GAP－43在耳鸣大鼠听皮层的表达 GAP－43广泛分布于大脑、小脑、海马以及脊髓、背根神经节和自主神经系统。体外培养脊髓神经元的结果表明，GAP－43的表达与神经元的发育和可塑性有直接关系。研究表明，GAP－43是一种特异性的与神经细胞生长、发育和再生过程相关的蛋白质，在中枢神经系统发育过程中有较高水平的表达，尤其在生长锥处浓度很高，因而被认为参与了轴突的生长和突触的形成［5］。在轴突的可塑性的作用表现在诱导生长锥而不是支持轴突的延长，表明GAP－43是一个重要诱导轴突生长的促进分子［6］。GAP－43在体内外均短暂存在于大鼠中枢神经系统的未成熟的少突胶质细胞，在外周神经系统中存在于雪旺细胞前体、无髓鞘雪旺细胞。GAP－43表达于II型胶质细胞（星形胶质细胞）和一些反应性胶质细胞，而不表达于I型胶质细胞（扁平的原生质性星形细胞），说明GAP－43在中枢和外周的的神经可塑性中发挥重要作用［7］。本实验中水杨酸钠组大鼠听皮层中GAP－43蛋白阳性神经元的表达明显高于生理盐水组和空白对照组，而生理盐水组和空白对照比较差异无统计学意义，说明水杨酸钠组大鼠听皮层产生了新的连接，形成新的结构，这为大鼠耳鸣的维持起到了关键作用。

3.3 ARC在大鼠听皮层的表达 ARC是一种可被不同形式的神经活性迅速诱导的即刻早期基因，其表达不需要其他基因的转录，类似于效应基因。它的mRNA转运到树突，在突触活性位点选择性地聚集。这个过程依赖于NMDA（N－甲基－d－天门冬氨酸，N－methyl－D－aspartic acid）受体的活化，并且会被NMDA受体对抗物所阻碍［4］。突触是神经系统内进行信息传递的结构基础，其在结构及功能方面的可变性称为突触可塑性。突触可塑性与神经系统的发育、损伤后的修复以及学习记忆等重要脑功能的完成密切相关，而在条件刺激下诱发的突触传递功能的长时程改变，即长时程增强（long－term potentiation，LTP）和长时程压抑（longterm depression，LTD），是突触可塑性的主要表现形式。ARC的翻译发生在突触后致密区的多核糖体复合物内，其所编码的蛋白对树突构型及突触功能有一定的作用。新合成的ARC的m RNA迅速移至树突，并会选择性积聚在被激活的突触部位，这种机制确保了ARC蛋白定位的树突区域已经接受了强的可塑性活性［8］。ARC的蛋白在神经可塑性中具有多重功能，可以影响突触的LTP和LTD以及突触内环境稳定可塑性。ARC的表达已经成为整个大脑神经元活性的一种标记。本实验中ARC蛋白阳性神经元在各组大鼠听皮层中均有不同程度的表达，水杨酸钠组表达明显高于生理盐水组和空白对照组，而生理盐水组和空白对照组比较没有明显统计学差异，说明注射水杨酸钠造成的耳鸣引起了大鼠听皮层中活动性增加，ARC蛋白神经元的表达明显增加说明ARC蛋白参与了耳鸣大鼠听皮层的重塑。而在行为试验研究发现，ARC能够维持长程增强效应和巩固长程空间记忆，推测ARC可能是持久改变的标记［4］。因此说明，ARC蛋白参与了耳鸣大鼠听皮层的重塑，对耳鸣的维持起到重要作用。

注射水杨酸钠可以诱导大鼠产生耳鸣的可能原因很多，而听皮层神经元可塑性变化与耳鸣的产生和维持存在密切关系。在水杨酸钠诱导耳鸣大鼠的听皮层中，GAP－43和ARC的表达明显升高，说明听皮层的神经元可能发生了重塑，提示耳鸣与听皮层神经元的重塑密切相关，为耳鸣的中枢发生机制提供了一个理论依据。

1 王洪田，田嘉禾，尹大一，等，耳鸣相关脑区的正电子发射断层成像［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2000，35：420.

2 Kawasaki T，Nishio T，Kawaguchi S，et al.Spatiotemporal distribution of GAP－43 in the developing rat spinal cord：A histological and quantitative immunofluorescence study［J］.Neurosci Res，2001，39：347.

3 李明，杨光，关颖，等.耳鸣动物行为模型的制作［J］.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2003，11：108.

4 Mahlke C，Wallhäusser－Franke E.Evidence for tinnitus－related plasticity in the auditory and limbic system，demonstrated by arg3.1 and c－fos immunocytochemistry［J］.Hear Res，2004，195：17.

5 许建中，李起鸿.生长相关蛋白－43与周围神经损伤及再生［J］.中华创伤杂志，1999，15：391.

6 Strata P，Buffo A，Rossi F.Mechanisms of axonal plasticity［J］.Arch Ital Biol，1999，137：181.

7 Sensenbrenner M，Lucas M，Deloulme JC.Expression of two neuronal markers，growth－associated protein 43 and neuron－specific enolase，in rat glial cells［J］.J Mol Med，1997，75：653.

8 Rial Verde EM，Lee－Osbourne J，Worley PF，et al.Increased expression of the immediate－eary gene Arc／Arg3.1 reduces AMPA receptor－mediated synaptic transmission AMPA［J］.Neuron，2006，52：461.

（2009－09－24收稿）

（本文编辑 雷培香）

Expression of GAP－43 and ARC in the Auditory Cortex of Rats Experiencing Tinnitus

Su WenIing，Zhao De＇an，Gao Xingqiang，Liu Qinghua，Wei Tingting，Zhao Yan
（Department of OtorhinoIaryngoIogy－Head＆Neck Surgery，The First AffiIiated HospitaI of Xiamen University，Xiamen，361003，China）

Objective To investigate the expression and the possible role of GAP－43（growth associated protein，GAP－43）and ARC（activity regulated cytoskeleton associated protein，ARC）in the auditory cortex of rats which experienced tinnitus.Methods Twenty－four white Wistar rats were randomly distributed into 3 groups：sodium salicylate group（n＝8），physiological saline group（n＝8）and the control group（n＝8）.Tinnitus was induced by salicylate administration and evaluated by behavioral conditioning techniques，and fluorescence quantitative PCR was used to observe the expression of GAP－43 and ARC in the auditory cortex in each group.ResuIts GAP－43 and ARC positive neurons were observed in all rats.The expression of GAP－43 and ARC in the sodium salicylate group was significantly higher than that of other two groups（P＜0.01）.ConcIusion The higher expression of GAP－43 and ARC in the auditory cortex of rats experiencing tinnitus suggests their important roles in the mechanism of tinnitus.

Tinnitus； Genes，GAP－43 and ARC； Auditory cortex； Sodium salicylate

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.03

R339.16

A

1006－7299（2010）04－0320－04

* 厦门市科技局资助项目（3502z20064017）

1 厦门大学附属第一医院耳鼻咽喉－头颈外科（厦门 361003）；

2 厦门大学附属第一医院中心实验室

苏文玲，女，福建人，副主任医师，研究方向为耳显微外科、耳神经外科基础及临床研究。

赵德安（Email：zhaoda＠263.net）； 高兴强（Email：xingqiang7211＠yahoo.com.cn）