邻苯二甲酸酯对斑马鱼胚胎发育的联合毒性*

何秀婷，李 潇，杨永涛，2，李凯彬，李桂英，聂湘平

(1．暨南大学水生生物研究所，广东 广州 510632；2.济宁学院生命科学与工程系，山东 曲阜 273155；3．中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380；4．中国科学院地球化学研究所，广东 广州 510640)

邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)是一类应用广泛的人工合成工业有机化合物质，主要用作为增塑剂，以提高产品的可塑性和强度，也普遍用于农药、涂料、印染、油漆、化妆品、香料和生活用品的生产。由于PAEs极易迁移进入环境，且难以降解，随着塑料橡胶制品的广泛应用，在大气、水体、土壤、生物体乃至人体都发现PAEs的存在[1-2]。研究表明PAEs类化合物具有雌激素作用，能够干扰人体内正常的内分泌从而影响生殖[3-4]；也有研究报道该类化合物存在致癌 、致畸、致突变和致哮喘的作用[5-6]。美国国家环保局(US EPA)将邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate, DMP), 邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate, DEP), 邻苯二甲酸二正丁酯(Dibutyl phthalate, DBP), 邻苯二甲酸丁基苄基酯(Butylbenzyl phthalate, BBP), 邻苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate, DOP), 邻苯二甲酸二异辛酯(Di-(2-etylhexyl) phthalate, DEHP) 6种 PAEs化合物列为优先控制的有毒污染物[7]，我国也将DEP、DMP和 DOP 3种PAEs化合物确定为环境优先控制污染物[8]。目前，对邻苯二甲酸酯类化合物的研究主要集中在单一污染物的毒性效应。而实际上这几种化合物常常是同时存在于环境中，生物体更多是处在这些化合物的混合暴露中。本研究以斑马鱼为模式生物，选择了4种养殖鱼体内被普遍检出的邻苯二甲酸酯类化合物[9]，即DMP、DEP、DBP和DEHP，探讨它们在斑马鱼胚胎发育过程的单一毒性和联合毒性效应，为这类物质风险管理提供有效的毒理学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

实验选用以4种邻苯二甲酸酯类：DMP、DEP、DBP和DEHP，均为分析纯，购于美国Accu Standard，INC。助溶剂丙酮为国产分析纯。

试验仪器包括; 倒置光学显微镜、可控光、控温循环水族箱、光照恒温培养箱和24孔细胞培养板。

1.2 实验动物

将成年斑马鱼(雌雄鱼数量比约为2∶1)斑马鱼饲养在经活性炭过滤并充分曝气的水体内，水体pH 8.34，总硬度为28～32 dH，保持(26±1)℃，光照/黑暗周期14 h/10 h，进行驯养。每日喂食2次经紫外消毒处理过的冷冻鱼食摇蚊幼虫(来自非污染环境，经检测四种受试化合物的含量低于检测限)。 根据Nagel法收集受精卵[10]。 鱼卵收集后，用水迅速清洗除去残留物，在倒置显微镜下挑选出分裂正常的受精卵，进行毒性试验。实验用水是曝气24 h以上的自来水。实验中空白对照组、溶剂对照组(0.1%丙酮)及处理组各设置三个平行。

1.3 实验方法

1.3.1 单一毒性实验 按照OECD[11]指南设计胚胎毒性试验。测试化合物的丙酮储备液用纯净水配制成水溶液，母液中的丙酮体积分数不超过0.3%，受试液中丙酮的体积分数不超过0.1%。开始实验前，分别配制4种PAEs 的5组质量浓度(DMP: 2.50, 5.00, 10.0, 20.0, 40.0 mg/L； DEP: 0.75, 1.50, 3.00, 6.00, 12.0 mg/L； DBP: 0.075, 0.15, 0.30, 0.60, 1.20 mg/L；DEHP: 0.250, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00 mg/L)备用。选用24孔多孔板，每孔的容积为3 mL，实验时每孔加入2 mL试液，放一枚受精卵。每张多孔板为一个实验浓度组，同时进行空白对照组和溶剂对照组(φ=0.1%丙酮)。铝箔封面以避免蒸发改变实验浓度。将密封好的多孔板放在温度恒定为(26±1)℃的光照培养箱中孵化。在倒置显微镜下观察胚胎发育，记录发育过程中一些具有代表性的毒理学终点[12]，并记录48 h胚胎死亡数，用概率单位法计算48 h LC50值。

1.3.2 联合毒性试验 在已测得48 h半数死亡质量浓度(LC50)的基础上，每种化合物设定高、中、低3个实验质量浓度(见表1)，考虑到各因素之间可能存在的联合交互作用，采用四因素三水平L27(313)正交表把试验分为27组，每组设3个平行，测试各混合物对斑马鱼胚胎的毒性效应，并记录各试验组48 h的胚胎死亡数、孵化数和畸形数。

表1 4种邻苯二甲酸酯混合暴露对斑马鱼胚胎发育影响的正交试验因素水平表

1.4 数据处理

单一毒性试验根据胚胎48 h的死亡数，用概率单位法计算48 h半致死质量浓度(LC50-48)。联合毒性试验中考虑4种邻苯二甲酸酯类化合物混合暴露中单因素和两两交互作用对斑马鱼胚胎的毒性效应大小的影响，结果以平均死亡率、平均孵化率和平均致畸率表示。数据采用极差分析法筛选出对斑马鱼胚胎致死毒性、发育毒性和致畸毒性影响最大的水平组合。极差越大，代表4种PAEs的联合作用时该因素对斑马鱼胚胎毒性的影响越大；极差越小，代表4种PAEs的联合作用时该因素对斑马鱼胚胎的毒性的影响越小。

2 结 果

2.1 单一毒性试验

根据各组48 h死亡率，以概率单位计算LC50值，试验结果见表2。

对暴露在邻苯二甲酸酯类溶液里的斑马鱼胚胎进行观察可以发现：暴露4 h后观察，部分胚胎发育出现异常，原本应该光滑的胚胎细胞表面出现了一些包状突起(见图1：d)，且多见于动物极，随着时间的延长，包状突起逐渐变大，导致出现细胞自溶现象(见图1：e、f)。经过一段时间(一般不超过延长期)后导致卵凝结(见图1：g)。

图1 PAEs暴露下斑马鱼胚胎不同发育时期形态变化图

暴露8 h后观察，进入原肠胚期的胚胎细胞有部分出现卵黄囊分裂异常，形成卵黄外突，也会出现胚胎细胞的自溶现象(见图1：j、k、l)，导致卵凝结。原肠胚期胚层运动的方式是外包，胚胎因外包功能的缺失而妨碍前后体轴的形成，而导致了以上异常的产生[13]。

暴露12 h后观察，胚胎处于分裂期，肌节开始形成(见图1：m)，为器官形成的初级阶段，暴露后的胚胎可能会出现尾部畸变和卵黄囊异常(见图1：o)。

暴露24 h和48 h后观察，由于这个时期的胚胎处在成形期和孵化期，尾部已经与卵黄囊分离，且色素沉积较多(见图1：n)，很容易观察到形体、心脏和血液循环系统的发育，可发现有部分胚胎出现心包肿大、心率缓慢、脊椎和尾部弯曲，色素沉积减少等现象(见图1：p)。

表2 四种邻苯二甲酸酯类对斑马鱼胚胎的48 h LC50值

2.2 联合毒性试验

4种邻苯二甲酸酯混合暴露时对斑马鱼胚胎死亡率、孵化率和致畸率的影响正交试验结果如表3所示，正交试验极差分析见图2。

图2 4种PAEs混合暴露对斑马鱼胚胎发育正交试验的死亡率、孵化率和致畸率的极差分析

2.2.1 PAEs混合暴露对斑马鱼胚胎致死毒性影响 在4种邻苯二甲酸酯类化合物混合暴露中DEP对斑马鱼胚胎死亡率的影响最大,其次是DMP,最小的是DEHP。但通过正交试验分析，混合暴露中DBP与DEHP的交互作用对斑马鱼胚胎致死毒性的影响最大。其次为DBP和DEP以及DMP和DEHP的交互作用。当DEP、DMP、DBP和DEHP分别以0.10, 2.50, 0.20和0.80 mg/L的质量浓度混合暴露时对斑马鱼胚胎死亡率的影响最大。

2.2.2 PAEs混合暴露对斑马鱼胚胎发育毒性影响 在4种邻苯二甲酸酯类化合物混合暴露中，DEP和DMP对斑马鱼胚胎死亡率的影响较大，DEHP对胚胎死亡率的影响最小。正交试验分析表明DBP和DEHP的交互作用对斑马鱼胚胎孵化率的影响最大,其次是DEP和DBP交互作用以及DMP与DEHP的交互作用。当DEP、DMP、DBP和DEHP分别以0.10, 2.50, 0.01, 0.40 mg/L的质量浓度混合暴露时对斑马鱼胚胎的发育毒性影响最大。

2.2.3 PAEs混合暴露对斑马鱼致畸毒性影响 在4种邻苯二甲酸酯类化合物混合暴露中DBP对斑马鱼胚胎孵化率的影响最大,其次是DMP,最小的是DEP。而4种邻苯二甲酸酯交互作用对胚胎孵化率的影响不大。当DEP、DMP、DBP和DEHP分别以0.90, 5.00, 0.20和 0.40 mg/L的质量浓度混合时对斑马鱼胚胎的致畸毒性影响最大。

3 讨 论

根据48 h半致死质量浓度，4种邻苯二甲酸酯类化合物对斑马鱼胚胎的毒性大小依次为DBP>DEHP>DEP>>DMP，不同种类PAEs的毒性效应各有不同，这可能这与邻苯二甲酸酯链上的碳链长度有关，碳链越长相对脂溶性越强，对斑马鱼胚胎的毒性越大。有文献报道4种邻苯二甲酸酯类化合物对绿藻Selenastrumcapricornutum的毒性大小为DEHP>DBP>DEP>DMP[14]。Naoki等研究了虾(Brine Shrimp)卵分别在DMP、DEP和DBP的溶液中孵化，结果表明3种PAEs的毒性大小为DBP>DEP>DMP[15]；与本研究的结果有相似之处。Yang等[16]和Liu等[17]分别对鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)的胚胎进行酞酸酯类化合物毒性试验，发现上述4种PAEs的毒性大小依次为DBP>DMP>DEP>DEHP，有研究认为由于DEHP侧链较长，有较高的脂溶性，使其难于渗透到胚胎细胞中，因此表现出比其它3种PAEs毒性低[18]。高质量浓度(大于或等于半致死质量浓度)的PAEs会造成斑马鱼胚胎在短时间内就凝结死亡；而较高的浓度(在不致死的情况下)会导致胚胎同时出现发育阻滞、色素沉积减少、心包水肿并伴有心率减慢、脊椎和尾部畸形、卵黄囊异常等毒性指标的4种以上；暴露在较低质量浓度(小于半致死质量浓度)PAEs下的斑马鱼的胚胎只会出现以上毒性指标的一种或同时出现两种，一般多表现为为脊椎和尾部弯曲。

表3 4种邻苯二甲酸酯混合暴露对斑马鱼胚胎发育影响的正交试验及其结果1)

1) m1：水平1平均值；m2：水平2平均值；m3：水平3平均值。

在混合暴露中，4种邻苯二甲酸酯类化合物对斑马鱼胚胎致死毒性和发育毒性的影响相似,影响程度的大小依次为DEP>DMP>DBP>DEHP,结果不同于单一毒性试验, 这可能是由于混合暴露中各化合物之间存在协同或者拮抗的效应。

DBP和DEHP在混合暴露中的交互作用对斑马鱼胚胎的致死毒性和发育毒性的影响相对较大，二者间可能发生协同作用导致毒性加强；同样DBP和DEP、DMP和DEHP间也会发生协同作用。

DMP和DBP交互作用时对斑马鱼胚胎致死毒性的影响与DMP单因素的影响程度是相似，而对斑马鱼胚胎发育毒性的影响则比DMP单因素的影响都强, 说明二者交互作用时，DMP对斑马鱼胚胎致死毒性的影响起主导作用，但对斑马鱼胚胎发育毒性DBP和DMP表现为协同作用。

DEP对斑马鱼胚胎致死毒性和发育毒性的影响比其它3种邻苯二甲酸酯的影响要大，当DEP分别和DMP、DEHP、DBP交互时，DEP对联合毒性的影响起主导作用，只有当DEP和DBP交互作用时对斑马鱼胚胎致死毒性和发育毒性的影响会加强，表现为协同作用；而当DEP与DMP交互时，对斑马鱼胚胎致死毒性和发育毒性的影响比二者单因素的影响都要小，说明DEP和DMP之间存在拮抗作用。

当DEHP与其他几种PAEs交互作用时，往往会使其毒性变大。

4种邻苯二甲酸酯类化合物联合作用对斑马鱼胚胎致畸毒性的影响结果不同于对其致死毒性和发育毒性的影响。DBP和 DMP在混合暴露中对斑马鱼胚胎致畸毒性的影响都很大，而正交分析表明二者交互时其影响程度降低，DBP和DMP对胚胎致畸毒性表现为拮抗作用； DMP和 DEHP交互作用的情况与 DBP和 DMP交互作用的情况相同，二者之间也出现拮抗作用；相反， DEP和DEHP对斑马鱼胚胎混合暴露致畸毒性的影响相对比较小，但正交分析DEP和DEHP交互作用对胚胎致畸毒性的影响程度显著升高，说明二者之间存在协同作用。

在邻苯二甲酸酯类化合物混合暴露中，4种不同的化合物酯对斑马鱼胚胎致死毒性、胚胎发育毒性和胚胎致畸毒性过程中会表现出协同或拮抗不同作用的影响，其确切机理还有待进一步的研究。复合污染物暴露产生的毒性效应较单一的污染物复杂，它们的毒性效应与介质及不同污染物的组合关系、污染物的浓度、暴露的对象和暴露方式等因素密切相关。

4 结 论

1)DMP、DEP、DBP和DEHP对斑马鱼胚胎的48 h LC50值分别为5.06、0.89、0.20和0.77 mg/L，毒性大小依次为DBP、DEHP、DEP、DMP。

2)在所设计的四因素三水平正交试验的浓度范围内，4种PAEs混合暴露过程中，DBP和DEHP交互作用对斑马鱼胚胎致死毒性和发育毒性影响最大，而DEHP影响却是最小。DBP对斑马鱼胚胎的致死毒性和发育毒性的影响相对较小，但对斑马鱼胚胎的致畸毒性的影响很大，在混合暴露中DBP就会导致胚胎发育的严重畸形。而DMP和DEHP交互作用的影响最小。

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