丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的影响

王迎春 刘炎芳 朱瑞萍

随着人们生活方式及饮食习惯的改变，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为最常见的慢性肝病，其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可进展为肝硬化及肝功能衰竭，目前缺乏有效的治疗手段［1］。体内外实验证明，丹酚酸B具有清除氧自由基及抗肝纤维化作用［2］，对NASH可能有治疗作用。为此，本研究通过高脂饮食复制大鼠NASH模型，探讨丹酚酸B对实验性大鼠NASH的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠36只，体重150 g左右，购自大连医科大学实验动物中心。大鼠正常饮食喂养1周后，随机分为3组(n=12)，即对照组、NASH模型组及丹酚酸B治疗组。对照组给予普通饲料，其余各组均给予高脂饲料(88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇)喂养。实验动物自由饮水和进食，分笼饲养于(20±2)℃明暗各12 h动物室内。于12周处死模型组。治疗组每天以浓度为1 mg/ml的丹酚酸B溶液20 ml/kg灌胃，同时继续高脂饲料喂养，对照组以20 ml/kg蒸馏水灌胃，同时继续普通饲料喂养。于实验第24周处死剩余实验动物，隔夜禁食，次日以2%戊巴比妥钠溶液按1.5 ml/kg腹腔内注射麻醉，下腔静脉采血后处死，迅速取出肝脏，按常规制备血清和肝组织石蜡切片，在肝右叶固定部位切取肝组织液氮保存待测。称体重、肝脏湿重，并计算肝指数(肝湿重/体重×100%)。

1.2 主要试剂及药品 链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫染色超敏试剂盒、鼠抗TIMP-1单克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发公司，按试剂盒说明书进行操作。丹酚酸B购自四川本草植物化工有限公司。

1.3 血清生化指标测定 血清TG、TC、ALT、AST测定，按试剂盒规范操作，全自动生化分析仪检测。

1.4 肝脏生化指标测定 在相同部位精确称取肝脏1.0 g，加入预冷的生理盐水，在冰水中制成10%的均浆，4℃3000 r/min离心15 min，提取上清液，用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)，所有操作均按产品说明书进行。

1.5 组织病理学检测 福尔马林固定肝标本，石蜡切片进行HE染色，在光镜下观察肝脂肪变性和炎症活动情况。肝细胞脂肪变性判断标准:肝小叶未见脂滴肝细胞为阴性，脂滴肝细胞占肝细胞总数小于1/3为(+)，1/3～2/3为(++)，大于2/3为(+++)，几乎均呈脂滴肝细胞为(++++)。炎症活动度计分标准参考Knodell提出的慢性肝炎组织学活动指数(HAI)进行计分，分为汇管区炎症(P)，小叶内炎症(L)，碎屑坏死(PN)及桥状坏死(BN，包括多小叶坏死)四项，每项依此计分为1、2、3、4分，因为BN、PN的严重程度与预后直接相关，故计分2倍于其他病变，计分公式为P+L+2(PN+BN)。

1.6 免疫组织化学检测肝组织TIMP-1的表达 采用SP法作免疫组织化学染色，切片常规脱蜡、水化、抗原修复、脱水、透明、树胶封片。采用KL型免疫图象处理系统进行半定量指标判断:未见阳性细胞为(-)，阳性细胞占肝小叶全部肝细胞的1/3以下为(+)，1/3～2/3为(++)，2/3以上为(+++)。为保证实验结果的可靠性，特别是免疫组织化学的特异性，本实验采用省略一抗和二抗，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.7 RT-PCR法检测肝组织TGF-β1mRNA的表达 采用美国GIBCO公司生产的一步法。

总RNA提取试剂盒，TRIZOL试剂按说明书操作提取总RNA，PCR 反应体系内含 cDNA 2 μl、10хbuffer 5 μl、4хdNTP(2 mmol)2μl、TGF-β1、GAPDH 引物各 2 μl，Taq 酶 1U，超重水补至20μl。TGF-β1 上游引物 5’CTT CAG CTC CAC AGA GAA CTG C 3’，下游引物 5’CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C 3’，GAPDH上游引物5’CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATG G 3’，下游引物 5’CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG 3’。各取1μg总RNA抽取物加入此反应体系进行PCR循环，循环参数为:97℃ 2 min、94℃ 30sec、56℃30sec、72℃50sec，50次循环。取PCR扩增产物10μl加入2%琼脂糖凝胶中在TAE缓冲液50V 1 h电泳，溴化乙锭显色成像定量分析，结果经计算机图像灰度扫描数字转换后进行统计学处理，以目的基因条带光密度值与内对照GAPDH条带光密度值的比表示目的基因相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件分析，计量资料采用方差分析，等级资料采用秩和检验。

2 结果

2.1 生化指标的检测:与对照组相比，模型组血清 ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA等显著增高，治疗组较模型组显著下降。见表1。

表1 各组大鼠生化指标的检测结果()

表1 各组大鼠生化指标的检测结果()

注:a模型组与对照组比较，P值均＜0.01;b治疗组与模型组比较P值均＜0.01

组别 n ALT(U/L) AST(U/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) MDA(nmol/mg蛋白)对照组 12 42.50±5.58 112.43±16.72 0.82±0.32 1.32±0.27 2.36±0.24模型组 12 72.48±8.32a 215.53±29.83a 1.36±0.44a 2.15±0.42a 4.82±0.57a治疗组 12 39.16±8.25b 102.26±18.41b 0.73±0.53b 1.16±0.54b 2.68±0.87b

2.2 肝脏指数及病理学变化:与对照组相比，模型组肝脏指数明显升高;高脂饮食引起大鼠肝脏明显的脂肪变性，模型组脂肪变性明显，炎症活动度计分显著高于对照组。丹酚酸B治疗组炎症活动度计分显著低于模型组。见表2。

表2 各组大鼠肝脏指数及病理学变化()

表2 各组大鼠肝脏指数及病理学变化()

注:模型组与对照组比较，a P值＜0.05，aa P值＜0.01;治疗组与模型组比较，b P值＜0.05，bb P值＜0.01

炎症活动度计分对照组组别 n 肝脏指数 肝细胞脂肪变性程度- + ++ +++ ++++12 0.026±0.001 12 0 0 0 0 0模型组 12 0.036±0.001a 0 0 0 0 12 5.23±0.87aa治疗组 12 0.030±0.001b 0 3 2 5 2 1.84±0.52bb

2.3 TIMP-1及TGF-β1mRNA的表达:TIMP-1检测阳性信号呈现棕黄色颗粒状，分布在肝细胞浆内，未见细胞核着色。与对照组相比，模型组TIMP-1表达明显升高;与对照组相比，模型组TGF-β1mRNA的表达显著升高，丹酚酸B治疗组TGF-β1mRNA的表达显著低于模型组。见表3。

表3 各组大鼠肝组织中TIMP-1及TGF-β1mRNA的表达()

表3 各组大鼠肝组织中TIMP-1及TGF-β1mRNA的表达()

注:模型组与对照组比较，a P值均＜0.01;治疗组与模型组比较，b P值＜0.05，bb P值＜0.01

1mRNA对照组组别 n TIMP-1-+++ +++ TGF-β 12 12 0 0 0 0.56±0.09模型组 12 0 6 4 2a 0.85±0.10治疗组 12 5 6 1 0b 0.62±0.05bb

3 讨论

NASH是以肝细胞脂肪变性、气球样变、弥漫性肝小叶炎症、肝细胞坏死、肝中央静脉及肝窦周围胶原沉积为特征的慢性肝脏疾病，二次打击理论目前是NASH的主要发病机制，其发生与胰岛素抵抗(IR)密切相关［3］。首次打击由IR和脂肪酸代谢紊乱引起脂肪肝;二次打击在IR的基础上，由氧应激、脂质过氧化、线粒体功能不全、细胞因子等引起肝细胞炎症、凋亡、坏死并促发纤维化进程，导致NASH及NASH相关肝硬化的发生。IR与一次打击造成的肝内脂质蓄积相互作用，形成脂质代谢的恶性循环，机体通过线粒体呼吸链、微粒体细胞色素P450(CYP)、过氧化物酶体等途径产生活性氧自由基(ROS)。当肝内产生的ROS超过抗氧化系统清除能力时便产生氧化应激，而脂肪肝时肝内蓄积的脂肪为氧化应激提供了足够的反应基质。脂肪酸氧化产生肝毒性的ROS，从而加速氧化应激过程，推动了脂肪肝向肝炎及肝纤维化发展的进程。其通过三个主要的机制［4，5］:脂质过氧化、细胞因子的诱导以及Fas配体的诱导作用。ROS激活的血浆或线粒体膜脂质过氧化导致细胞坏死或诱导细胞凋亡。脂质过氧化同样激活丙二醛(MDA)的释放，后者一方面能与肝细胞蛋白结合，形成抗原，激活有害的免疫反应，本研究证实NASH模型组肝组织MDA的含量明显增高;另一方面与线粒体的膜脂、膜蛋白交联，使膜的流动性降低，影响膜中酶的活性，干扰了脂肪酸的β氧化，加重脂肪在肝内蓄积，形成恶性循环。ROS同样增加肝细胞中Fas配体的表达，通过Fas配体与相邻肝细胞上正常表达的Fas受体相作用，诱导细胞凋亡。ROS还激活转录因子NF-κB活性，从而增加炎性细胞因子TNF-a、TGF-β1、IL-6等的产生，TGF-β1为致肝纤维化最重要的细胞因子之一，通过与HSC等细胞膜上的TGF-β受体结合，经细胞内信号传导中介分子smads蛋白的传导，将肝脏炎症损伤等信息传递给细胞核，启动基因转录，从而启动肝脏对炎症损伤等的修复机制，大量合成细胞外基质(ECM)。基质金属蛋白酶(MMPs)可以降解多种细胞外基质成分，其活性受基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的调节，TIMP1在肝纤维化的形成过程中起着重要的作用，本研究表明TIMP-1及TGF-β1mRNA的表达在NASH模型组明显增高。

丹酚酸B为丹参干燥根及根茎中提取的有效成分，是丹参水溶性成分中最重要的活性物质，具有很强的抗氧化作用。本研究表明丹酚酸B治疗组炎症活动度计分、MDA含量及TIMP-1和TGF-β1mRNA的表达均显著低于NASH组，提示丹酚酸B具有抑制脂质过氧化反应及抗肝纤维化作用，其机制可能为丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，减少MDA的产生，从而减少肝细胞的损伤，抑制TGF-β1的产生和HSC的增殖活化，具有抗肝纤维化作用。NASH目前缺乏有效的治疗方法［6］，因此，丹酚酸B作为治疗NASH有效药物之一，有待于进一步研究。

［1］中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南.中华肝脏病杂志，2010，18(3):163-166.

［2］刘成海，刘平，胡义杨，等.丹酚酸B盐对转化生长因子-β1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用.中华医学杂志，2002，82(18):1267-1272.

［3］Ramesh S，Sanyal AJ.Evaluation and management of nonalcoholic steatohepatitis.J Hepatol，2005，42(1):2-12.

［4］Albano E，Mottaran E，Vidali M，et al.Immune response towards lipid peroxidation products as a predictor of progression of nonalcoholic fatty liver disease to advanced fibrosis.Gut，2005，54(7):987-993.

［5］Diehl AM，Li ZP，Li HZ，et al.Cytokines and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis.Cut，2005，54(2):303-306.

［6］Torres DM，Harrison SA.Diagnosis and therapy of nonalcoholic steatohepatitis.Gastroenterology，2008，134:1682-1698.