翻白草总黄酮降血糖作用的药效学研究

孙海峰，常虹，杨婷，王江凤

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

翻白草为蔷薇科委陵菜属植物翻白草(Potentilla discolor Bunge.)的带根全草，主要分布在北半球的温带和寒带。《本草纲目》载其:气味甘，微苦，性平，无毒;有清热解毒、凉血止血功效，主治肺热咳喘、泻痢、咳血、吐血、痈肿疮毒等［1］。近年来民间流行用翻白草治疗糖尿病并取得一定疗效。现有研究表明，翻白草具有降血糖作用［2，3］。翻白草所含的黄酮类成分为其降血糖的主要有效成分［4］，本实验以翻白草总黄酮富集物为材料，研究其对2型糖尿病大鼠空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素等指标的影响，探讨翻白草治疗2型糖尿病的作用机制，为翻白草的开发利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

PHB－5笔式酸度计(上海伟业仪器厂);日立KY2000半自动生化仪(天津开元医疗设备有限公司);恒温水浴箱(江苏金坛市医疗仪器厂);微量移液枪(上海荣泰生化工程有限公司);电子分析天平(梅特勒－托利多上海有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);K－Q500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

翻白草总黄酮富集物(黑龙江中医药大学生药学实验室提供);糖脉康颗粒(成都中汇制药有限公司，国药准字Z10970026);0.9%NaCl注射液(哈药集团制药六厂);链脲佐菌素(美国sigma公司提供，批号:S0130);胰岛素放射免疫试剂盒(北京市福瑞生物工程公司);葡萄糖注射液(哈药集团三精制药有限公司);蔗糖(沈阳市新西试剂厂生产);葡萄糖(天津市科密欧化学试剂有限公司);冰醋酸(天津市耀华化学试剂有限责任公司);柠檬酸、胆固醇(天津市凯通化学试剂有限公司);柠檬酸钠(天津市博迪化工有限公司);葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司，批号:20090101);SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:20090527);丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号:20090527)。

1.3 实验动物

健康wistar大鼠75只，体重(200±20)g，雌雄各半(上海斯莱克实验动物有限责任公司)。

2 方法

2.1 药品及试剂配制方法

柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液的配制:精密称取柠檬酸2.100g，溶于100mL重蒸馏水中，精密称取柠檬酸钠2.900g，溶于100mL重蒸馏水中，将柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液按1∶1.32配成pH值为4.4的溶液(现用现配并用酸度计准确测定)，用0.22μm滤膜除菌，备用。

1%链脲佐菌素溶液的配制:精确称取链脲佐菌素100mg，溶于10mL柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液中，摇匀(此操作在冰盒上进行，并且避光，所配溶液在30min内用完)。

高糖高脂饲料的制备:由10%猪油，2.5%胆固醇，1%胆酸钠，20%蔗糖，以及66.6%的基础饲料组成。

翻白草总黄酮富集物低、中、高剂量组配制方法:精密称取翻白草富集物粉末14.2g、28.4g、56.8g，分别加入282mL蒸馏水，摇匀即得;糖脉康颗粒溶液:取糖脉康颗粒40g加入148mL蒸馏水，摇匀，待用。

2.2 糖尿病大鼠模型的造模与分组

采用喂养高糖高脂饲料加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法。75只Wistar雄性大鼠自购置后适应性饲养3天后，将大鼠随机分为两组，空白组10只给予基础饲料，模型组65只喂以高糖高脂饲料1个月后，于实验前禁食不禁水12h，模型组一次性腹腔注射1%的STZ溶液50mg·kg－1，正常组给予同体积的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液。72h后尾静脉采血测空腹血糖，选择血糖值大于11.1mmol·L－1的大鼠作为实验性糖尿病动物模型，除空白组10只外，共有40只大鼠成模。将其随机分为模型对照组、糖脉康组、翻白草总黄酮富集物高、中、低剂量组五组，每组8只。

2.3 实验给药方案

空白对照组和模型对照组大鼠灌胃给予等体积生理盐水。阳性药物对照组大鼠灌胃给予1.35g·(kg·d)－1糖脉康溶液;翻白草总黄酮高、中、低剂量组分别灌胃给予 36g·(kg·d)－1、18g·(kg·d)－1、9g·(kg·d)－1翻白草总黄酮药液。实验各组均连续灌胃15d。

2.4 各实验组糖尿病大鼠空腹血糖的测定

大鼠连续灌胃15d后，各组均禁食不禁水12h，随后眼内眦取血，置离心管中3500r·min－1离心10min，按血糖试剂盒，采用葡萄糖氧化酶法结合分光光度法测定大鼠空腹血糖值。

2.5 各实验组糖尿病大鼠糖耐量的测定

大鼠连续灌胃15d后，禁食不禁水12h，检测空腹血糖值作为零时血糖值，随后按3g·kg－1剂量灌胃给予各组大鼠葡萄糖溶液，分别在注射后0.5h、1h及2h测定大鼠血糖值，观察各实验组大鼠血糖变化情况。

2.6 各实验组糖尿病大鼠血清胰岛素水平的测定

检测糖耐量后第2天，各实验组禁食不禁水12h，眼内眦取血，置离心管中3500r·min－1离心10min，精密吸取血清100μL，按照放射免疫试剂盒说明操作，测定大鼠血清胰岛素水平。

2.7 各实验组糖尿病大鼠胰岛素敏感性指数的测定

胰岛素敏感性指数(insulin sensitivity index，ISI)计算公式为ISI=Ln［1/(FINS×FBG)］，其中 FINS为血清胰岛素水平，FBG为空腹血糖含量。将实验各组FINS和FBG值分别代入公式计算胰岛素敏感性指数值。

2.8 各实验组糖尿病大鼠超氧化物歧化酶(SOD)的测定

检测糖耐量后第2天，各实验组禁食不禁水12h，眼内眦取血，置离心管中3500r·min－1离心10min，用半自动生化仪检测超氧化物歧化酶(SOD)。

2.9 各实验组糖尿病大鼠MDA的测定

检测糖耐量后第2天，各实验组禁食不禁水12h，眼内眦取血，置离心管中3500r·min－1离心10min，用半自动生化仪检测MDA。

2.10 各实验组糖尿病大鼠胰腺组织形态的观察

大鼠麻醉采血处死后，迅速取出脾脏周围的胰腺，置于福尔马林液中固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm切片，HE染色后进行光镜检查。

3 结果

3.1 各实验组糖尿病大鼠血糖水平 结果见表1。

表1 各实验组大鼠血糖水平(±s)

表1 各实验组大鼠血糖水平(±s)

注:与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

组别 例数(n)给药前血糖(mmol·L －1)给药后血糖(mmol·L －1)空白对照组 8 5.62±1.32 5.13±1.06**糖尿病模型组 8 15.31±3.3 17.07±4.7阳性组 8 15.21±3.77 12.36±5.24翻白草总黄酮低剂量组 8 15.34±3.26 10.94±6.07翻白草总黄酮中剂量组 8 15.28±3.32 9.49±4.87*翻白草总黄酮高剂量组 8 15.18±2.86 9.31±5.61*

翻白草总黄酮富集物高剂量组、中剂量组空腹血糖值显著低于糖尿病模型组(P<0.05);低剂量组空腹血糖值与糖尿病模型组比较无显著性差异(P>0.05)。

3.2 各实验组糖尿病大鼠糖耐量 结果见表2。

表2 各实验组大鼠糖耐量(±s)

表2 各实验组大鼠糖耐量(±s)

注:与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

组别例数(n)血清葡萄糖(mmol·L－1)空白对照组 8 5.13±1.06 8.75±2.41**7.73±3.34**6.04±1.15**糖尿病模型组 8 17.07±4.7 26.32±3.31 23.32±2.83 20.54±3.37阳性组 8 12.35±5.24 22.56±4.55 19.27±3.87 13.31±2.02翻白草总黄酮低剂量组8 10.94±6.07 23.89±2.22 20.54±2.68 15.53±2.98翻白草总黄酮中剂量组8 9.49±4.87 19.09±2.47*16.42±2.51*11.54±3.02*翻白草总黄酮高剂量组8 9.31±5.61 19.19±3.21*16.89±2.54*11.78±2.78*

正常组大鼠血糖于灌胃给与3g·Kg－1葡萄糖0.5h后迅速升高并达峰值，以后血糖开始下降。模型组大鼠血糖于糖负荷后持续升高，虽于2h有所降低，但与糖负荷前血糖浓度相比变化不大。翻白草总黄酮富集物中、高剂量组在糖负荷后0.5h达峰值，血糖升高幅度均明显小于模型组(P<0.05)，2h后降低至糖负荷前血糖水平附近，与模型组血糖比较有显著性差异(P<0.01)，表明翻白草对糖尿病大鼠的糖耐量有改善作用。

3.3 各实验组糖尿病大鼠血清胰岛素水平 结果见表3。

表3 各实验组大鼠血清胰岛素水平(±s)

表3 各实验组大鼠血清胰岛素水平(±s)

注:与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

组别 例数(n) 血清胰岛素(μIU·mL－1)空白对照组 8 8.26±1.92**糖尿病模型组 8 25.75±7.84阳性组 8 16.68±4.84翻白草总黄酮低剂量组 8 17.39±4.25翻白草总黄酮中剂量组 8 15.16±4.08*翻白草总黄酮高剂量组 8 10.34±1.98*

翻白草总黄酮富集物高剂量组、中剂量组血清胰岛素显著低于糖尿病模型组(P<0.05);低剂量组血清胰岛素值与糖尿病模型组比较无显著差异(P>0.05)。

3.4 各实验组糖尿病大鼠胰岛素敏感性指数 结果见表4。

表4 各实验组大鼠胰岛素敏感性指数(±s)

表4 各实验组大鼠胰岛素敏感性指数(±s)

注:与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

组别 例数(n)胰岛素敏感性指数空白对照组 8－3.74±1.72**糖尿病模型组 8－6.08±5.81阳性组 8－5.32±3.74翻白草总黄酮低剂量组 8－5.24±3.15翻白草总黄酮中剂量组 8－4.96±3.18*翻白草总黄酮高剂量组 8－4.56±1.32*

翻白草总黄酮富集物高剂量组、中剂量组胰岛素敏感性指数显著高于糖尿病模型组(P<0.05);低剂量组空腹血糖值与糖尿病模型组比较无显著差异(P>0.05)。

3.5 各实验组糖尿病大鼠超氧化物歧化酶值(SOD)结果见表5。

表5 各实验组大鼠SOD值(±s)

表5 各实验组大鼠SOD值(±s)

注:与模型对照组比较，*P<0.05。

空白对照组8 378±29.85糖尿病模型组 8 305.68±24.19阳性组 8 311.76±20.15翻白草总黄酮低剂量组 8 321.3±60.7翻白草总黄酮中剂量组 8 350.26±12.29*翻白草总黄酮高剂量组 8 345.05±23.1*

翻白草总黄酮富集物高剂量组、中剂量组SOD显著高于糖尿病模型组(P<0.05);低剂量组SOD与糖尿病模型组比较无显著差异(P>0.05)。

3.6 各实验组糖尿病大鼠MDA值 结果见表6。

表6 各实验对大鼠MDA值(±s)

表6 各实验对大鼠MDA值(±s)

注:与模型对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

组别 例数(n)MDA(nmol·mL －1)空白对照组 8 5.95±1.13**糖尿病模型组 8 7.62±0.79阳性组 8 6.73±1.14翻白草总黄酮低剂量组 8 7.33±1.03翻白草总黄酮中剂量组 8 6.26±0.91*翻白草总黄酮高剂量组 8 6.45±0.97*

翻白草总黄酮富集物高剂量组、中剂量组MDA显著低于糖尿病模型组(P<0.05);低剂量组MDA与糖尿病模型组比较无显著差异(P>0.05)。

3.7 各实验组糖尿病大鼠胰腺组织形态

空白对照组大鼠(图1):胰岛呈圆形或椭圆型，边界清晰，胰岛细胞排列规整;模型对照组大鼠(图2):胰岛明显萎缩，边界模糊，胰岛细胞排列紊乱，其数量较正常对照组明显减少，并有明显的细胞肿胀、坏死现象，细胞核可见染色不清或深染，有核固缩现象;阳性对照组大鼠(图3):胰岛边界较清晰，细胞数量较模型对照组有所增加，细胞形态较好，无明显细胞肿胀、坏死，核清晰;翻白草总黄酮低剂量组(图4)与模型对照组相近，胰岛改善程度小;翻白草总黄酮中(图5)、高(图6)剂量组大鼠胰岛的结构形态有不同程度改善，胰岛边界较清晰，细胞数量较模型对照组增加，其中高剂量组胰岛恢复结果显著，细胞结构完整，无明显肿胀坏死，无核固缩现象，接近正常胰岛结构。

说明翻白草中、高剂量能修复胰岛组织，表现出促进胰岛组织再生的作用，且其高剂量效果优于阳性药物。

附图:

图1 空白组大鼠胰岛组织形态

图2 模型对照组大鼠胰岛组织形态

图3 阳性对照组大鼠胰岛组织形态

图4 翻白草总黄酮低剂量组大鼠胰岛组织形态

图5 翻白草总黄酮中剂量组大鼠胰岛组织形态

图6 翻白草总黄酮高剂量组大鼠胰岛组织形态

4 讨论

现代医学认为，2型糖尿病的最显著特征就是胰岛素β细胞分泌缺陷和胰岛素抵抗，其在中医学属于“消渴症”范畴，病因有饮食损伤、燥热太甚等说［5］。中药翻白草，其性味甘、苦、平，有清热解毒，改善消渴症状的功效。研究表明，天然药物黄酮通过多种机制发挥降糖作用［6］，翻白草中主要降血糖有效成分为黄酮类物质。本实验表明，翻白草总黄酮富集物通过改善模型大鼠的各项指标发挥作用。

实验组空腹血糖值与模型对照组相比，实验组(中、高剂量组)经翻白草总黄酮治疗后，空腹血糖均显著降低，表明翻白草对糖尿病大鼠具有一定的降糖作用。实验组血清胰岛素水平与模型对照组相比，实验组(中、高剂量组)经翻白草总黄酮治疗后，血清胰岛素水平均显著降低，同时，实验组(中、高剂量组)胰岛素敏感指数显著高于模型对照组。表明翻白草能降低糖尿病大鼠的血清胰岛素，提高胰岛素敏感指数，减轻胰岛素抵抗。

自由基可引发多种不饱和脂肪酸过氧化而生成过氧化脂质(LPO)，其最终产生丙二醛(MDA)能使蛋白质、核酸、脂类发生交联，使生物膜发生变性，细胞突变、衰老或死亡。体内超氧化物歧化酶(SOD)为直接清除自由基的酶，可阻断自由基，促使产生LPO的链式反应，从而保护细胞不受自由基的损害。糖尿病大鼠抗氧化防御体系受抑制，自由基产生率大于清除率，而LPO的升高与SOD活性降低呈负相关，同时与血糖升高呈正相关，说明血糖升高与自由基引起的脂质过氧化有直接关系［7，8］。本实验检测血清MDA含量及SOD活性结果:实验高、中剂量组的血清SOD活性明显增高，血清MDA含量明显减少，说明翻白草总黄酮可以提高糖尿病大鼠机体SOD活性，清除自由基，并抑制脂质过氧化作用。

胰岛细胞观察结果显示，翻白草总黄酮中、高剂量组都不同程度修复胰岛β细胞，表明翻白草具有显著的修复胰岛组织，促进胰岛组织再生，从而促进胰岛素分泌，改善胰岛素β细胞分泌缺陷。

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