高效液相色谱法测定活血镇痛胶囊中阿魏酸含量

陈 福

（浙江省舟山市人民医院，浙江 舟山 316000）

活血镇痛胶囊是舟山市中医骨伤联合医院根据老中医经验方自制的制剂，主要由当归、丹参、赤芍、三七、土鳖虫等10味中药组方，具有活血祛瘀、行气镇痛等功效，临床用于治疗跌打损伤、气滞血瘀等各种痛证。该制剂目前尚无质量标准，为了保证药品质量，笔者参考有关文献[1-2]，采用高效液相色谱（HPLC）法测定了方中当归的阿魏酸含量。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200 Series高效液相色谱系统，包括G1311A四元泵、G1329A自动进样器、DAD检测器；USC-502型超声处理器（上海波龙电子设备有限公司）。阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号为0773-9910，含量测定用）；乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯；活血镇痛合剂（舟山市中医骨伤联合医院制剂室，批号为 20090305，20090501，20091001）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：DiamonsilTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -乙腈 -1%冰醋酸（20∶10∶70）；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，阿魏酸与其他组分完全分离，分离度大于1.5，理论塔板数以阿魏酸计不低于3 000。

2.2 溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的阿魏酸对照品19.20 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取此贮备液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成质量浓度为15.36 μg/mL的对照品溶液。取样品约1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入70%的甲醇50 mL，超声30 min，过滤，弃去初滤液，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。按处方比例和制法制成缺当归的阴性样品，取阴性样品约1 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：取2.2项下3种溶液，在上述色谱条件下分别进样，色谱图见图1。可见，供试品溶液中阿魏酸色谱峰与其他组分峰完全分离，阴性对照品溶液对阿魏酸的测定无干扰。

线性关系考察：精密吸取对照品贮备液0.1，0.4，0.8，1.6，2.0，3.2 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别按拟订的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y）、对照品质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程 Y=83.931 X-19.585，r=0.999 8（n=6）。结果表明阿魏酸质量浓度在 3.84 ～122.88 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验：取同一对照品溶液，依法重复进样6次。结果阿魏酸峰面积的 RSD为0.6%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按拟订的色谱条件于24 h内每隔一定时间进样测定。结果峰面积的 RSD为0.8%（n=6），表明供试品溶液在室温下至少24 h内稳定。

重现性试验：取同一批（批号为20090501）样品5份，依法测定。结果阿魏酸含量分别为 99.46，100.54，101.08，97.57，98.65 μg/g，平均99.46 μg/g，RSD为1.4%（n=5），表明方法重现性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的样品（批号为080603）6份，分别精密加入阿魏酸对照品适量，依法测定含量并计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

分别吸取对照品溶液及供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，外标一点法计算含量。结果见表2。

3 讨论

关于HPLC法测定阿魏酸含量的报道较多[1-4]，一般多采用不同浓度的甲醇或乙醇作为提取溶剂。本试验曾分别用乙醇、50%甲醇和70%甲醇作溶剂提取，结果用乙醇和50%甲醇提取溶液颜色较深，杂质峰较多，色谱峰分离不理想，且供试品对色谱柱损害较大；用70%甲醇提取所得溶液杂质峰较少，阿魏酸较稳定，故选用70%甲醇作为提取溶剂。曾比较了用70%甲醇水浴回流30 min和用70%甲醇超声30 min，结果发现，这两种提取方式对阿魏酸峰面积没有影响，但回流方式较烦琐，且回流中装置不容易洗干净，故选用超声方式。进一步分别采用超声30，60，90 min不同时间提取样品，结果表明超声30 min时阿魏酸能提取完全，为了节省试验时间，故选用超声30 min。

表1 阿魏酸加样回收试验结果（n=6）

表2 样品含量测定结果

为了得到较理想的色谱峰，根据阿魏酸的性质用不同厂家、不同型号的色谱柱进行了比较，结果用Agilent Extend C18柱和Agilent Zorbax SB C18柱时阿魏酸峰前拖尾较严重，柱效不高；用Hypersil ODS柱阿魏酸峰的出峰时间较长；DiamonsilTMC18柱既能达到很高的柱效，又可使杂质峰得到较好分离，且出峰时间合适。

[1]黄东萍，文东旭，林文翰.HPLC法测定川芎及天芎注射液中阿魏酸的含量[J]. 中草药，2004，35（4）：409-411.

[2]王瑞明，苏 强，倪 艳，等.HPLC法测定安脑痛中阿魏酸的含量[J].中成药，2003，20（2）：164-165.

[3]阍雪梅，赵慧萍，严色红.HPLC法测定通脉颗粒中阿魏酸的含量[J].中草药，2003，34（2）：230-231.

[4]闵凡新，李文玉，王彦为，等.HPLC法测定当归中阿魏酸的含量[J].中草药，2004，35（3）：332-333.