10种中药提取物对耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究*

李伟奇,刘湘新,李俊超,贺建华*

(1.湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙 410128;2.湖南农业大学动物科技学院,湖南长沙 410128;3.湖南农业大学动物医学院,湖南长沙 410128)

10种中药提取物对耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究*

李伟奇1,2,刘湘新3,李俊超3,贺建华1,2*

(1.湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙 410128;2.湖南农业大学动物科技学院,湖南长沙 410128;3.湖南农业大学动物医学院,湖南长沙 410128)

为了解研究中药提取物对耐药菌的抑菌作用,采用纸片法和倍比稀释法研究10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用;用点种法和药敏纸片法研究耐药抑转作用。结果显示,10种中药水提物中黄芩水提取物对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌抑制效果最明显。耐药性抑制试验结果表明,只有黄芩水提取物对Sa1的耐药性有明显的抑制作用,抑制率达65%,但对其他菌株的抑制作用则表现不明显;药敏纸片法显示黄芩对细菌耐药性有最强抑制作用。表明中药水提取物对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌有抑制作用,且部分药物抑菌作用明显;黄芩水提取物对Sa1菌株具有耐药逆转作用。

水提取物;耐药金色葡萄球菌;体外抑菌试验;中药

*通讯作者

随着抗菌药物在临床医学上的广泛应用,细菌对抗菌药物的耐药问题日趋严重,其耐药水平越来越高,出现了多重耐药菌株,给人类和动植物的健康带来极大的危害,细菌耐药性问题已经成为全球关注的一个热点[1-2]。由于耐药性是细菌在不良生存环境下产生的本能生理反应,是适应环境维持生命所必需的特性,因而不管研制什么样的新一代药物都不可能完全避免细菌耐药性的产生[3]。为此,研究耐药性抑制剂,关系到人类和动植物的健康。近年来,世界各国除继续致力于筛选对耐药菌有效且具有新抗菌谱、新作用机制的抗生素之外,还开始寻找能够提高抗生素效能、颉颃细菌耐药性的物质。已有研究显示,一些化学试剂虽有逆转多重耐药的功效,但因其具有较大的毒副作用,使临床应用受到限制[3]。从20世纪90年代至今,相关研究报道表明[2],某些中药具有逆转耐药性的作用,因此,从我国天然、低毒的中药中筛选耐药抑制剂,成为人们关注的热点。本试验在前人研究的基础上,探讨了10种中药对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑制作用和耐药逆转作用,以期为中药耐药抑制剂的研究开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌(Sa1 、Sa2 、Sa3、Sa4 、Sa5)均由中国农业大学提供,其 MIC值见表 1;金黄色葡萄球菌标准菌ATCC25923(Sa)由湖南农业大学动物医学院基础兽医实验室提供。

表1 金黄色葡萄球菌耐药谱Table 1 The spectrum of Staphylococcus aureus resistant to fluoroquinolones μg/mL

1.1.2 药品 黄芩、艾叶、细辛等中药购自长沙养天和大药房;环丙沙星原料药购自湖南农业大学动物药厂。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备 耐药金黄色葡萄球菌用营养琼脂培养基平板37℃培养18 h～24 h,挑选典型菌落接种于肉汤中,再经37℃肉汤培养18 h后,将菌液稀释至105～106个菌/mL备用[4-5]。

1.2.2 中药水提物的制备 10种中药水提取液的制备[8-9]:药物与水以1∶10比例浸泡24 h,80℃中回流提取2 h,过滤;滤渣再加5倍量体积水回流提取2 h,过滤;合并滤液,浓缩至含生药1 g/mL[6-7]。1.2.3 药敏纸片法 取含生药1 g/mL的中药水提液溶液1.5 mL,放入直径为6 mm的灭菌滤纸片(10片为1组)50片,浸泡2 h。待其自然干燥后,用紫外线照射灭菌10 min～15 min。取灭菌后的琼脂培养基15 mL,倒入已灭菌的平皿内,使其厚度为4 mm,待冷却凝固后,每个平皿划分为4区,用移液枪吸取0.1 mL菌液于平皿内,用玻棒铺匀,然后贴上含有药液的纸片,置37℃培养箱中培养24 h,用游标直尺测定抑菌圈直径,取平均值,判定按NCCLS 2008年标准进行[10]。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 参照NCCLS推荐的微量稀释法(microdilution method)进行。相同过程重复3次。

试管法[11]:中药提取液由于颜色太深,难于直观判定。因此用葡萄糖酚红液体培养基代替普通培养基。取60支灭菌带棉塞的试管,每12支为一组,编号。在超净台上每支试管内分别加入葡萄糖酚红肉汤培养基1.0 mL。将配制药液作二倍递减浓度稀释(即1～10号试管内药物浓度依次为0.5、0.25、0.125 、0.062 5 、0.030 8 、0.016 、0.008 、0.004 、0.002和0.001 g/mL)。然后在1号～10号试管每管分别加入菌液 0.1 mL,第11号试管只加肉汤和药液1 mL,不加菌液,作为对照,观察药物是否污染,第12号试管加葡萄糖酚红液体培养基1.0 mL,菌液0.1 mL,作为细菌对照,观察细菌是否正常生长。然后将试验管和对照管置 37℃的培养箱中培养24 h后取出,观察并判定药物对此菌株的最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.5 最低杀菌浓度(MBC)的测定 金色葡萄球菌发酵葡萄糖产酸,有细菌生长的酚红指示剂变为黄色,药液透明管直接判读[12-13]。凡是色泽深暗管,在培养24 h后用移液器分别吸取0.1 mL培养物,移种于不含药的普通营养琼脂上,轻轻推开药液,置37℃培养过夜。观察有无细菌生长,按一般规定,平皿培养基中,计数应少于5个菌落者作为该药物的最低杀菌浓度(MBC);反之,无细菌生长各试验管培养物,经移种于平皿培养基后,各浓度均有细菌生长,该药物为抑菌作用无效。

1.2.6 耐药性抑制试验测定 采用平板点种法[3]。将试验用耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌(Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5)分别在不含药物和含亚抑菌浓度的中药水提取液的LB液体培养基中培养24 h,取出少量菌液经稀释后(OD在0.3～0.5之间)涂布于普通琼脂培养基上培养,16 h后获得大量单个菌落,选取200个单个菌落,然后一一对应,将单个菌落点种于含亚抑菌浓度环丙沙星的琼脂培养基,培养18 h～20 h,观察并依据公式计算耐药菌抑制率。抑制率=(点种菌落数-药物平板生长菌落数)/点种菌落数。

药敏纸片法[14]。试验用金黄色葡萄球菌在含亚抑菌浓度中药LB培养基中培养24 h,取出少量稀释(约1 000倍,以获得薄层菌苔为宜)后每个平板培养基涂布0.1 mL,待培养基表面干燥后将药敏纸片贴于培养基表面,37℃培养18 h观察。

1.2.7 数据分析 试验数据均采用SPSS13.0和Excel 2003进行数据统计、方差分析和t检验。

2 结果

2.1 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果

2.1.1 抑菌圈直径测定结果 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌不同菌株的抑菌圈直径见表2,结果表明,黄芩对5种耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌不同菌株体外抑制作用最强,其次是艾叶、马兜铃等,半夏作用最弱。

2.1.2 MIC测定结果 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的MIC测定结果见表3,结果表明,黄芩对5种耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的MIC最低,说明其抑菌作用最强,其次是艾叶、罗汉果等,半夏最大。同时,同一药物对不同菌株的MIC不同。

表2 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌5种株型的抑菌圈直径Table 2 The Bacteriostasis circle diameters of water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to resistant fluoroquinolones S.aureus mm

表3 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌5种株型的MIC值Table 3 The MIC Values of the water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to S.aureus which resistant to fluoroquinolones g/mL

2.1.3 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的MBC测定结果 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的MBC测定结果见表4。结果表明,黄芩对5种耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的MBC最低,其次是艾叶、罗汉果等,半夏最大。同时,同一药物对不同菌株的MBC也不同。

表4 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的MBC值Table 4 The MBC Values of the water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to S.aureus which resistant to fluoroquinolones g/mL

2.2 耐药性抑制试验测定结果

2.2.1 平板点种试验结果 10种中药水提物的平板点种试验结果见表5。

表5 10种中药水提取液对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌抑制结果Table 5 The bacteriostasis effects of water extracts of 10 kinds traditional Chinese medicine on fluoroquinolone-resistant S.aureus

2.2.2 药敏纸片法试验结果 10种中药水提物的药敏纸片法试验结果见表6。

表6 10种中药水提物的药敏纸片法试验结果Table 6 The drug sensitive test of water ex tracts of 10 kinds traditional Chinese medicine to fluoroquinolones-resistant S.aureus mm

3 讨论

3.1 10种中药水提取物对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌的作用

统计分析结果表明,10种中药水提取物对耐氟喹诺酮类药物金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,其中以黄芩水提取物抑菌效果最为明显(其中3个试验组与对照组的P＞0.05,说明试验组和对照组差异不显著,试验结果基本相同),对Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5的抑菌圈分别可达到 19.6 mm±0.4 mm、20.7 mm±1.7 mm 、18.6 mm ±0.9 mm、20.5 mm±1.2 mm和18.6 mm±1.6 mm;对 Sa2、Sa5的 MIC值仅为 0.008 g/mL,对其他菌株为0.016 g/mL;其余中药水提取物按抑菌作用强度由强到弱依次为艾叶、罗汉果、马兜铃、细辛、紫苏子、矮地茶、枇杷叶、银杏、半夏。此外,有一部分中药对标准菌株和耐药菌的抑菌作用强度基本相同(各试验组与标准菌株对照组之间的P＞0.05为差异不显著,P＜0.05为差异显著),表现为对西药耐药的细菌在中药的作用下并不耐药,由此说明中药对细菌的抑制作用与化学药物有很大的区别,对化学药物耐药的细菌对中药不一定耐药。

3.2 中药MIC测定方法探讨

本试验中采用葡萄糖酚红LB液体培养基代替普通的液体培养基,利用了细菌发酵葡萄糖产酸,使酚红指示剂变为黄色的特性,解决了中药MIC不易测定的难题,使试验结果便于直观的判定。判定结果时,若药液透明可以直接读取,若混浊,吸取0.1 mL涂布琼脂培养基,37℃培养18 h后观察结果,以无菌生长的最低稀释度为该中药粗提物的MIC。

3.3 耐药性抑制试验

平板点种法结果表明,10种中药水提取物中仅有黄芩水提物对Sa1的耐药性有明显的抑制作用,但对其他菌株的抑制作用则表现不明显。药敏纸片法显示,黄芩、半夏、紫苏子对细菌的耐药性都有一定的抑制作用,矮地茶、枇杷叶、银杏、艾叶只对部分细菌耐药性有抑制作用,其他的中药则没有作用(各试验组与对照组之间P＜0.05),所得结果与平板点钟法的结果有很大不同,此结果可能是由于中药通过不同的途径抑制细菌耐药性产生的综合效果。同时单方中药在一定程度上能降低细菌的耐药性,效果却并不是太明显。但这仅是体外抑菌试验,中药体外作用表现为单一耐药性的丢失,体内作用却表现为多重耐药性的丢失[15],相信在对单方中药进行合理配比之后定能做出更有效的复方中药,这将在后续研究中进一步来验证。本试验为细菌体外抑制试验,而大多数报道体内抑制试验效果好于体外抑制实验[15]。对于中药抑制细菌耐药作用的机制,中药抑菌的机制,中药的有效组分的研究暂时还没有确切结论,一般认为中药成分复杂,各组分的效果在不同条件下所起的作用不尽相同,与西药有特定的作用靶位不同,中药抑制细菌是一个系统协同作用的结果。

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Inhibition Effects of 10 kinds of Traditional Chinese Medicine Extracts on Drug-resistantS.aureus

LI Wei-qi1,2,LIU Xiang-xin3,LI Jun-chao3,HE Jian-hua2

(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China;
2.College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China;
3.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan,410128,China)

The disquisition studyies on the inhibition effect of herb extracts onS.aureusresistant to the fluoroquinolones were conducted.The inhibition effects of water soluble extract of 10 kinds of Chinese medicine onS.aureusresistant to the fluoroquinolones were investigated by paper disk method and tube dilution methodin vitro,and the MIC of scutellarias extracts on pathogenic bacteria was measured.The inhibition rate of 10 kinds Chinese medicine extracts to fluoroquinolone-resistantS.aureuswas measured by the point to point grow method and drug sensitive test.T he results showed the water soluble extracts of scutellarias had biggst inhibition effect in10 kinds of Chinese medicine,it showed significant inhibition effect to fluoroquinolone-resistant of Sa1,the inhibition rate is 65%.In the drug sensitive test,the water soluble extracts of scutellarias shows a great inhibition effect too.It indicated that water soluble extracts of 10 kinds of Chinese medicine had significantly bacteria-inhibition effect to drug-resistantS.aureus,some medicines showed evident inhibition effect.Scutellarias extract had resistant-reverse effect to Sa1 resistant ot fluoroquinolones.

water soluble extract;drug-resistantStaphylococcus aureus;inhibition effect;traditional Chinese medicine

S859.3

A

1007-5038(2010)09-0041-05

2010-02-25

国际科技合作计划项目(2009DFA32350);国家科技支撑计划项目(2007BAQ01047)

李伟奇(1985-),男,湖南长沙人,硕士研究生,主要从事动物营养与健康研究。