猪肺炎支原体YN200901株的分离鉴定*

杨贵树,毕峻龙,杨金凤,蒲杨柳,周建琼,尹革芬

(云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201)

猪肺炎支原体YN200901株的分离鉴定*

杨贵树,毕峻龙,杨金凤,蒲杨柳,周建琼,尹革芬*

(云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201)

采集疑似猪肺炎支原体病理变化的肺脏,接种到改良牛心培养基、猪胃消化液培养基进行培养,经瑞特染色、镜检,菌落狄氏染色、PCR鉴定及序列比对、生化试验鉴定,抗猪肺炎支原体血清生长抑制试验,分离获得一株猪肺炎支原体云南地方流行菌株,命名为YN200901。试验结果为云南本地株猪肺炎支原体的后续研究提供了物质基础。

猪肺炎支原体;YN200901株;分离鉴定

*通讯作者

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)又称猪地方流行性肺炎(Swine enzootic pneumonia),俗称猪喘气病[1]。猪支原体是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一[2],可继发感染PRRSV、PCV等,从而导致多种疫苗接种失败[3-4]。猪支原体可经空气传播,此外还易与其他细菌性疫病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发[5-6],对养猪业造成重大经济损失。是当前常发生、流行广、难净化的重要疫病之一。

猪肺炎支原体常呈亚临床感染,长期以来对该病原的检测主要以病原菌的分离鉴定为主。由于猪肺炎支原体生长条件苛刻、营养要求高、生长速度缓慢,使得本病的控制常呈现滞后状态,影响了其在遗传、生化、免疫等方面的研究[7]。因此加快猪肺炎支原体的生长速度,可为猪肺炎支原体的诊断提供宝贵的时间。本试验对常规分离猪肺炎支原体的培养基进行改良,采用自制改良牛心培养基、猪胃消化液培养基进行猪肺炎支原体的培养,缩短了培养时间,成功分离获得了猪肺炎支原体,为猪肺炎支原体云南地方株的后续研究提供了物质基础和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 标准猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)菌株购自江西农业科学院畜牧兽医研究所。

1.1.2 病料来源 分别采自云南省各地疑似猪肺炎支原体病变肺脏,共10份。

1.1.3 培养基的制备 参照“中华人民共和国农业行业标准”猪肺炎支原体分离培养基制备方法,根据需要略有改动。

1.1.4 生化试剂 均购自北京索莱宝科技有限公司

1.2 方法

1.2.1 病原分离培养 将病料放在无菌平皿中剪成1 mm3的小块,直接接种于培养基中,37℃培养10 d～14 d,每天观察记录培养基颜色变化情况[8]。1.2.2 镜检 用铂耳挑取液体培养基中的菌液涂片,自然干燥经甲醇固定后,用瑞特染色30 min,然后镜检。

1.2.3 菌落狄氏染色 采用无菌方法从固体培养基上切下菌落,放到载玻片上,在两边垫上竹签,滴上狄氏染色液后再盖上一块玻片,用石蜡密封后,置于4℃染色30 min后低倍镜下观察结果。

1.2.4 PCR鉴定 根据GenBank中MHP16s rDNA中基因系列设计一对特异性引物,MHP-F 5′-GAG CCT TCA AGC TTC ACC AAG A-3′,MHPR 5′-TAT GTT AGT GAC T TT TGC CAC C-3′并提交上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。优化反应体系及条件,对PCR产物进行序列测定及分析。

1.2.5 生化试验 从毛地黄皂甙敏感性试验开始,接着是尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(T TC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验。

1.2.6 血清学鉴定 将直径为6 mm的滤纸片高压灭菌烘干后,每片用0.02 mL猪肺炎支原体抗血清浸透,室温空气干燥,置-30℃冰箱中保存备用。试验时将分离菌的纯培养菌液以滚滴法接种于固体培养基上,当液体吸收后,贴上含猪肺炎支原体抗血清的纸片,于37℃恒温培养,每天观察记录,出现菌落后记录结果。

2 结果

2.1 培养结果

培养11 d后,培养基变黄色均匀混浊的液体。转接于固体培养基后,菌落生长入培养基内部。菌落呈典型“煎荷包蛋”状,与支原体菌落形态相符。

2.2 狄氏染色结果

在低倍镜下观察到,猪肺炎支原体的菌落被染成不褪色的中心深蓝色菌落(图1A),与支原体菌落染色特性相符;而细菌的菌落则退色(图1B)。

图1 狄氏染色结果Fig.1 Disse staining results of under light microscope

2.3 PCR鉴定

所提取的分离培养物模板用Mhp-F和Mhp-R引物经PCR扩增后,再经琼脂糖凝胶电泳检测,标准菌株及待检病料均在600 bp～700 bp之间相对应位置有一条带,与预期649 bp相符(图2)。

图2 PCR扩增结果Fig.2 Result of PCR

2.4 序列测定与分析

将所分离菌株PCR扩增产物测序与GenBank中Mhp部分序列进行同源性比较。结果可以看出,云南分离菌株16 S rRNA基因序列与参考菌株相应序列同源性为98.3%～100%(图3)。

图3 分离菌株PCR扩增产物测序比对结果Fig.3 Sequence alignments of isolation amplified by PCR

2.5 生化及血清学鉴定

分离菌株生化反应和标准菌株相同,符合支原体生化特性(表1)。

表1 分离菌株生化试验及血清学鉴定Table 1 Biochemical tests and serological identification of isolates

(续表1)

3 讨论

猪肺炎支原体除了能引起猪地方流行性肺炎外,也是猪呼吸道疾病综合症的一种原发性病原[9]。张其燕等[10]曾报道昆明某猪场发生猪支原体病。猪肺炎支原体营养要求高且生长缓慢,因此很难获得大量的菌株,造成了猪肺炎支原体诊断所需时间长、防控困难等,因此加快猪肺炎支原体的生长速度就显得非常重要。赵萍等[11]对丝状支原体山羊亚种最佳培养基进行优化筛选获得成功,提示可通过研究猪支原体的营养需求生理,在原有培养基的基础上进行改良,缩短培养周期。本试验在培养基的组成成分中使用牛心浸液、猪胃消化液、水解乳蛋白、NAD组合。这个组合中能很好提供支原体生长繁殖所需的含氮物质、核酸降解物、维生素及无机盐类,还能中和蛋白胨和琼脂所含有的阻碍细菌生长发育的物质,可以防止支原体向粗糙型变异,具有保持支原体毒力和毒性作用。另外,猪肺炎支原体的生物合成能力弱,加入NAD可以在猪肺炎支原体的呼吸过程中起到递氢作用[12]。通过试验证实该培养基能够很好的分离出猪肺炎支原体,在3 d内就可见菌株生长。其生长速度有了很大提高,为猪肺炎支原体的分离鉴定缩短了时间也为后续研究提供了基础。

从感染的肺脏中分离猪肺炎支原体是被推崇的“金标”诊断方法[13],但周期较长。建立快速检测方法有助于本病的研究和控制[14]。本试验通过设计针对MHP 16 S cDNA特异性引物进行PCR扩增,扩增得到一个大小为649 bp的特异性片段。经克隆、测序后与GenBank中Mhp部分序列进行同源性比较,为98.3%～100%。表明PCR鉴定和分离鉴定具有一致性,建立了一套快速准确的猪肺炎支原体PCR检测方法。

[1]李彦明,张 映.猪肺炎支原体生物学研究进展[J].动物医学进展,2003,24(3):25-27.

[2]王 华,张 清,王君玮,等.猪支原体肺炎流行病学和诊断技术研究进展[J].动物医学进展,2009,30(9):73-77.

[3]金升藻.猪支原体肺炎的诊断与综合防治[J].上海畜牧兽医通讯,2008(6):33-35.

[4]刘青海,车秀华,孙洪升.猪肺炎支原体的研究进展[J].畜牧兽医科技科技信息,2005(6):12-13.

[5]Dee S,Otake S,Oliveira S,et al.Evidence of long distance airbo rne transport of po rcine reproductive and respiratory syndrome virus andMycoplasma hyopneumoniae[J].Vet Res,2009,40(4):39.

[6]王茂文.猪肺炎支原体病的特点及其防制措施[J].畜禽业,2008(2):16-17.

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[8]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2001.

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[10]张其燕,杨晓花,杨富华.昆明某猪场暴发猪支原体肺炎的诊断和防治[J].动物医学进展,2007,28(2):115-116.

[11]赵 萍,储岳峰,高鹏程,等.丝状支原体山羊亚种最佳培养基的筛选[J].动物医学进展,2008,29(1):21-23.

[12]陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社,1995.

[13]Thacker E L,Mycoplasmal Disease[M].In:Straw BE,Zimmermann J J,DAllaire S,Taylor D J(Eds.),Diseases of Swine.Iowa State University Press,Ames,2006:701-717.

[14]刘茂军,张 映,邵国青,等.猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立[J].山西业大学学报:自然科学版,2009,29(5):444-447.

Isolation and Identification ofMycoplasma hyopneumoniaeYN200901 Strain

YANG Gui-shu,BI Jun-long,YANG Jin-feng,PU Yang-liu,ZHOU Jian-qiong,YIN Ge-fen

(College of Animal Science and Technology,Y unnan Agricultural University,Kunming,Yunnan,650201,China)

Samples from swine lungs with suspected pathological lesions due to swine enzootic pneumonia were collected,inoculated into improved cattle heart and pig stomach digestion medium for isolation and culture.Wright＇s staining,bacterial colony of disse staining,bacterial L-type identification,biochemical tests,anti-Mycoplasma hyopneumoniaegrowth inhibition test as well as PCR and sequence alignments for comfirming the bacteria strain were conducted.Based on the results,strain was isolated as swine pneumonia mycoplasma,enzootic in Yunnan province named YN200901 which can be applicable studies.

Mycoplasma hyopneumoniae;YN200901 strain;isolation and identification

S852.62;S858.28

A

1007-5038(2010)09-0022-04

2010-03-03

云南省高端科技人才引进计划项目(2009CI125)

杨贵树(1968-),男,云南昆明人,实验师,主要从事动物传染病防制研究。