应用 RAPD技术鉴定地霉的实验研究

郑树茂 王华 朱敬先 林元珠 高顺强

(1.河北医科大学第四医院皮肤科,石家庄 050011;2.河北省中医院皮肤科,石家庄 050011)

1 材料与方法

1.1 菌株

林生地霉皮损株与血液株由我科临床所得,均由中国科学院微生物研究所鉴定,白地霉标准菌株购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 试剂

DNA提取所用试剂购自美国 OMEGA公司。PCR试剂引物购自上海生工生物工程公司,GoTaq Green Master Mix,2X购自美国 Promega Corporation.

1.3 主要仪器

生物显微镜、低温变速离心机、恒温水浴箱、电子天平、电热式蒸汽消毒器、紫外可见分光光度计、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像分析系统。

1.4 DNA模板制备

取不多于 3 mL(<2×107个细胞)的菌悬液进行室温 4 000 r/min离心 10 min,弃去上清液,加480μL BufferSE,10μL 2-巯基乙醇和 20μL溶菌酶,30℃水浴不少于 30 min。室温 4 000 r/min离心 5 min沉淀,弃去上清液,加 200μL BufferYL、50 mg玻璃珠,轻摇 5 min将悬浮浮游物转移至另 1个1.5 mL的离心管中,加 200μL的蛋白酶 K,上下混匀,55℃震荡水浴裂解 1 h。然后加 5μL RNA酶A,摇晃数次,放置室温培养 5 min,室温 10 000 r/min离心 5 min,小心吸取悬浮物到离心管中。加220μL BufferYDL混匀,高速振荡 15 s,65℃水浴10 min。加 220μL的无水乙醇 (室温 96% ～100%)混匀,高速振荡 20 s。将 HibindDNA微量柱套在新的 2 mL收集管中将上述溶液过柱,10 000 r/min离心 1 min,弃去滤液。换新的收集管,加500μL BufferHB洗涤,10 000 r/min离心 1 min,弃去滤液。加 700μL Wash buffer(含乙醇)于微量柱中洗涤,10 000 r/min离心 1 min弃去滤液。再次加 700μL Wash buffer重复洗涤 1次。最大速度(≥10 000 r/min)空甩离心管,干燥柱子。换新的无核酸酶的 1.5 mL的离心管,加 50～100μL 65℃的 Elution buffer,室温下孵育 3～5 min,10 000 r/min离心 1 min洗脱。再加 50～100μL 65℃的 E-lution buffer重复洗脱 1次,最终存于离心管中的即为提取出的 DNA模板。将提取的基因组 DNA 2 μL放在分光光度计上测其含量、浓度及 OD值。

1.5 引物的设计与合成

选用随机引物 AP3(5'-TCGTAGCCAA-3')、随机引物 ATG(5'-ATGGATCGGC-3')、随机引物 RP2(5'-AAGGATCAGA-3')、随机引物 OPA-10(5'-GTGATCGCAG-3')。引物由生工生物工程 (上海)有限公司合成。

1.6 PCR扩增

PCR反应总体积为 25μL,其中含 12.5μL GoTaq Green Master Mix,2X(2X Green GoTaq Reaction Buffer PH8.5,400μmol/L dATP,400μmol/L dGTP,400μmol/L dCTP,400μmol/L dTTP及 3 mmol/L MgCL2),2μL引物 (25μmol/L),3μL模板 DNA(15μg/μL),双蒸水补足至总体积 25μL,离心数秒后上机循环。

参考相关文献设计的循环参数略作修改进行扩增。随机引物 RP2、随机引物 ATG的循环条件参照文献[1]的方案略作修改具体为 94℃ 5 min预变性,94℃1 min变性,36℃1 min退火,72℃2 min延伸,45个循环,72℃保持 10 min延伸;随机引物AP3、随机引物 OPA-10循环条件参照 Williams的方案[2]略作修改具体为 94℃ 5 min预变性,94℃1 min变性,40℃ 1 min退火,72℃ 2 min延伸,45个循环,72℃保持 10 min延伸。

1.7 琼脂糖凝胶电泳进行 PCR产物检测

取 8μL反应产物加入含溴化乙啶的 1.5%琼脂糖凝胶样品孔中,100 V恒压下电泳 30 min。电泳完毕,将凝胶移至凝胶成像分析系统下进行观察,照相并记录实验结果。

2 结 果

2.1 致病性地霉的种间鉴定

由 4种不同引物对白地霉、林生地霉皮损株和血液株进行扩增后得到相应的电泳条带,每张图片从左向右依次为 Marker、白地霉、林生地霉皮损株、林生地霉血液株 (见图 1～4)。由图可知,利用不同引物可以扩增出大小、数目不一的 DNA条带,其中 AP3、OPA-10和 RP2扩增的条带多态性都比较明显,分别有 1～5个 DNA片段被扩增,分子量在200～1 900 bp之间。不同种真菌的 DNA经扩增后显示不同的 DNA带型,同一模板经多次实验均产生一致的 DNA带型,而且不同次提取的同一种不同株真菌的 DNA经扩增后显示的主要 DNA带型也是相同的。

2.2 林生地霉的种内鉴定

由 4种不同引物对林生地霉皮损株、林生地霉血液株扩增后得到的电泳条带 (见图 1～4)来看,分离自不同感染部位的林生地霉皮损株和血液株经随机引物扩增后,分别有 1～5个 DNA片段被扩增,其中 AP3、ATG和 RP2扩增的条带多态性均不明显,DNA带型基本一致。对同一模板经多次实验均产生一致的 DNA带型。

3 讨 论

地霉菌属于腐物寄生性真菌,在自然界广泛存在,可自蔬菜、青草、肥料和土壤中分离出来,亦可在正常人的皮肤、黏膜、消化道、痰及粪便中检出[3-4]。地霉是一种条件致病性真菌,只有当机体免疫力降低时才致感染,可侵犯皮肤黏膜和内脏,以支气管感染最多见,偶可致全身播散性感染,其经典代表菌种为白地霉[5]。1979～2009年国内共报道有 9例白地霉感染。其中白地霉导致皮肤感染的有 2007年钟华等[6]报道的 1例先天性免疫缺陷病合并播散性马尔尼非青霉、白念珠菌及白地霉感染病例。2008年李秀丽等[7]首次报道了白地霉引起阴道炎 2例。而林生地霉为地霉属中新发现的 1个种,首次从巴西果蝇和印度柞蚕幼虫身上分离出[3]。从 2002年起我科先后从 1例脓癣患儿的皮损和 1例中毒性表皮坏死松解症患者的血液中分离出林生地霉[8-9],2006年黄文明[10]等从足部溃疡中再次分离处 1株林生地霉,说明本菌既能引起皮肤地霉病,也可导致系统性感染。

图 1 引物 AP3对不同地霉扩增后的电泳条带:1.2 000 bp标准参照物,2.白地霉,3.林生地霉皮损株,4.林生地霉血液株 图 2 引物ATG对不同地霉扩增后的电泳条带:1.2 000 bp标准参照物,2.白地霉,3.林生地霉皮损株,4.林生地霉血液株 图 3 引物 OPA-10对不同地霉扩增后的电泳条带:1.2 000bp标准参照物,2.白地霉,3.林生地霉皮损株,4.林生地霉血液株 图4 引物RP2对不同地霉扩增后的电泳条带:1.2 000 bp标准参照物,2.白地霉,3.林生地霉皮损株,4.林生地霉血液株Fig.1 PCR fingerprintsamplified with primer AP3:1.Marker,2 000 bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood Fig.2 PCR fingerprints amplified with primer ATG:1.Marker,2 000 bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood Fig.3 PCR fingerprints amplified with primer OPA-10:1.Marker,2 000 bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood Fig.4 PCRfingerprints amplified with primer RP2:1.Marker,2 000bp;2.G.candidum;3.G.silvicola isolated from the skin lesion;4.G.silvicola isolated from blood

地霉的常规鉴定主要是采用镜检、分离培养等,依据形态、生化特征对其进行分类鉴别。因为地霉中不同菌株之间菌落的形态差异不大,培养基的种类、培养温度和生长速率对其菌落的形态、质地和色泽的影响也不明显,临床在对地霉的鉴定过程中常会遇到一定的困难。另外镜检都有分支分隔的关节菌丝和关节孢子,不易鉴别,常规鉴定法通常需要 2～4周,费时长,菌落易被污染,以致失去鉴定的依据[11]。

RAPD技术以其特异性强、敏感性高、快速、简便等特点在真菌病的早期诊断上很有应用前景。虽然目前医学界对 RAPD技术的临床应用价值存在争议,但对于生长缓慢、培养阳性率不高、鉴定较为困难的地霉来说,RAPD技术仍不失为一种行之有效的方法,该方法借用的是 PCR技术,无需模板DNA的任何序列信息,不需对扩增产物进行酶切与测序,无需 DNA探针,不涉及 Southern杂交、放射自显影或其他技术,操作步骤少,实验周期短,灵敏度高,不受环境等因素的影响,能在较短的时间内对真菌做出准确的鉴定[12-13]。

运用 RAPD技术对地霉从分子生物学方面做鉴定,首先要提取其基因组DNA,但真菌 DNA的提取要比细菌及组织 DNA的提取困难的多,因为真菌的细胞壁结构坚固,次生代谢产物丰富,一般方法很难破其壁。目前,真菌 DNA提取的方法很多,主要区别就是破壁方法的不同,以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的差异。破壁方法包括氯化苄、酶解制备原生质体法和液氮冷冻研磨等化学裂解法。核酸分离方法包括经典的酚、氯仿抽提以及商品化的纯化柱、纯化膜分离法等。氯化苄、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)法在真菌 DNA提取中应用较广泛,但上述方法存在试剂毒性大、耗费时间长等缺点[14]。机械研磨法常采用液氮研磨,主要是借助超低温的液氮使真菌的细胞壁变脆,再通过研磨破坏细胞壁使染色体释放出来。此法需要收集较大量的菌体,在提取时为保证研磨充分常导致染色体 DNA受机械剪切力过度而形成碎片,操作过程不太容易掌握。

本研究中我们采用 E.Z.N.A.Yeast DNA Kit试剂盒,运用酶解法 (Lyticase solution and glass beads)溶细胞酶破壁,再裂解液进一步裂解,最后通过去除杂质的 DNA纯化过程,完成真菌 DNA提取。该方法的操作简单,不需要特殊设备,只需离心机、恒温箱等简单设备即可完成,而且完全避免了接触有毒试剂,且经过纯化过程,提取的基因组DNA其纯度和浓度均很高,能很好地满足 PCR反应的要求。

我们在获得适应 PCR扩增的基因组 DNA的基础上,选用随机引物 AP3、ATG、RP2、OPA-10,采用 RAPD技术,对林生地霉和白地霉的指纹图谱进行比较,从基因型的角度对其进行分类鉴别。4种引物扩增都可以产生特征性基因指纹,DNA条带多态性均比较明显,其中引物 AP3、OPA-10、RP2扩增得到的 DNA条带可以把白地霉和林生地霉明显区别开来。而采用 4种引物对林生地霉皮损株和血液株扩增得到的 DNA条带基本一致,这说明取自不同感染部位的同种不同株林生地霉基因型差异不明显。为避免假阳性的发生,我们实验中的每一组 PCR都设置了模板空白对照,空白均无产物,而且做了重复性实验;在实验中发现,不同次提取的同一株地霉菌的 DNA经扩增后显示相同的DNA带型,而且同一模板在多次实验中亦产生一致的DNA带型。从理论上讲,PCR技术可检测到单个菌细胞,因此菌落生长早期即可进行检测,检验时间可大大缩短,可实现临床的早期诊断并能进一步指导用药。

本研究表明,采用 E.Z.N.A.Yeast DNA Kit提取的地霉基因组 DNA可以用于 PCR反应。以随机引物 AP3、ATG、RP2、OPA-10为基础的 RAPD技术是一种理想有效的分子生物学诊断技术,它通过分析指纹图谱,从基因型的角度对地霉菌进行鉴别,操作简便、迅速,结果稳定、准确、可靠,便于大规模使用,特别适合于临床应用。

[1] 冯义国,肖生样,谭升顺,等.应用 AP-PCR进行真菌菌型鉴定的方法建立 [J].中国皮肤性病学杂志,2000,14(3):157-158.

[2] Williams JGK,Kubelik AR,Livak KJ,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primersare useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Res,1990,18(22):6531-6535.

[3] Pimenta RS,Alves PD,Correa A Jr,et al.Geotrichum silvicola sp.Nov.,a novel asexual arthroconidial yeast species related to the genus Galactomyces[J].Int J Syst Evol Microbiol,2005,55(Pt1):497-501.

[4] 谭升顺,秦振宇.地霉病[M]//秦启贤.临床真菌学.上海:上海医科大学出版社,2001:394-396.

[5] 王端礼.医学真菌学实验室检验指南[M].北京:人民卫生出版社,2005:253.

[6] 钟华,赵文利,孟刚,等.临床病例讨论—不规则发热 20天,伴口腔凝乳块样物 9天[J].中国真菌学杂志,2007,2(5):296-299.

[7] 李秀丽,辛德梅,顾小萍,等.我国首见白地霉引起阴道炎 2例及实验研究[J].现代妇产科进展,2008,17(4):300-301.

[8] 李秀丽,朱敬先,林元珠,等.我国首见由地霉引起的脓癣一例及实验研究[J].中华皮肤科杂志,2004,37(8):446-448.

[9] 高顺强,朱敬先,林元珠,等.中毒性表皮坏死松解症伴发林生地霉感染一例[J].中华皮肤科杂志,2006,39(1):648-650.

[10] 黄文明,樊翌明,白逢彦,等.从足部溃疡分离出林生地霉及其实验研究[J].中华皮肤科杂志,2006,39(8):448-449.

[11] 吴绍熙主编.现代医学真菌检验手册[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,2005:160.

[12] Cirak MY,Kalkanci A,Kustimur S.Use of molecular methods in identification of Candida species and evaluation of fluconazole resistance[J].Mem Inst Oswaldo Cruz,2003,98(8):1027-1032.

[13] 项明洁,彭奕冰,孙景勇,等.随机扩增多态性 DNA分型法用于酵母菌基因分型[J].上海第二医科大学学报,2005,25(6):572-573.

[14] 陈官芝,王云,徐秀莲,等.致病性真菌 DNA提取方法的实验研究[J].中华皮肤科杂志,2002,35(5):408-409.