119例非小细胞肺癌患者HGFK1蛋白表达的检测及其临床意义

周晓辉 杨异 高宗礼 范理宏 沈赞 岳麓

1.上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院呼吸内科，△心胸外科，*肿瘤内科，上海 200233；2.青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003

119例非小细胞肺癌患者HGFK1蛋白表达的检测及其临床意义

周晓辉1杨异△高宗礼△范理宏1沈赞*岳麓2

1.上海交通大学医学院附属上海市第六人民医院呼吸内科，△心胸外科，*肿瘤内科，上海 200233；2.青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003

背景与目的：研究表明，肝细胞生长因子的第一个环状结构域基因表达产物（the kringle 1 domain of hepatocyte growth factor，HGFK1）能够抑制血管生成，对于肿瘤的生长和转移有明显的抑制作用，但是至今尚未见HGFK1蛋白在肺癌中的表达及其临床价值的报道。本研究旨在探讨非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者中HGFK1的表达状态及其临床意义，从而为肺癌患者提供新的预后因子以及可能的潜在治疗靶点。方法：共收集119例NSCLC患者手术切除的标本，采用Western blot技术检测HGFK1在手术切除标本中的表达，并进一步分析HGFK1表达与患者临床病理生理特征的关系以及和预后的关系。结果：22.7%（27/119）的NSCLC患者存在HGFK1高表达，而正常肺组织中HGFK1的高表达率为68.7%（11/16），显著高于肺癌组织中的表达率；HGFK1基因的高表达与患者的年龄、性别、组织学类型以及吸烟状态无关（P＞0.05），但与病理分级和淋巴结转移显著相关；HGFK1高表达率在病理分级差（G3）的患者组织中较病理分级相对较好（G1、G2）的患者明显降低（11.5%∶31.3%），而在有淋巴结转移的患者组织中明显较无淋巴结转移者低（11.6%∶38.0%）；HGFK1阳性组患者的3年无疾病进展生存时间（progress free survival，PFS）以及总生存期（overall survival，OS）均显著长于HGFK1阴性组（P值分别为0.002和0.017）。结论：HGFK1的阳性表达率在正常肺组织中明显高于NSCLC组织，而不同的NSCLC患者癌组织中的表达也有差别，其中，在病理分级较好、无淋巴结转移的患者中阳性表达率高；HGFK1的表达与患者的性别、组织类型及吸烟状态等临床特征无明显关系，HGFK1表达阳性的患者3年PFS期和OS期显著长于HGFK1表达阴性的患者。

非小细胞肺癌； HGFK1基因； 预后

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率一直呈上升趋势，已成为主要的肿瘤死因之一［1-2］，严重威胁着人类的生命健康。近70%NSCLC患者在确诊时已经是晚期，而外科手术切除后3年生存率仍较低［3］。因此探讨NSCLC的发生、发展机制，提高早期诊断、早期治疗率，判断预后，延长患者的生存期，已成为肺癌研究的关键。肝细胞生长因子的第一个环状结构域基因（the kringle 1 domain of hepatocyte growth factor，HGFK1）表达产物于2000年首次被克隆于肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）的α链，具体位于肝细胞生长因子的第一个环状结构域［4］。本课题组的前期研究表明，HGFK1不但能够抑制肿瘤的血管生成，还能够直接抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡［5-6］。然而目前尚未见HGFK1在肺癌中的表达及意义的研究。本实验拟通过Western blot法检测NSCLC组织及正常肺组织内HGFK1蛋白的表达，探讨其与NSCLC临床分期、分化程度、淋巴结转移及预后的关系及相关性，初步探索其在NSCLC的发生、发展中的作用及临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集上海交通大学附属第六人民医院和青岛大学医学院附属医院2003年6月—2007年11月间经手术切除的119例NSCLC患者的标本，其中男性73例，女性46例，年龄32~80岁，中位年龄为61岁。所有患者均行肺癌根治术且经过组织病理学诊断证实。组织学类型按WHO标准分类：鳞癌57例，腺癌51例，腺鳞癌6例，大细胞肺癌5例。按国际抗癌联盟（UICC）标准（1997）进行临床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期17例，Ⅲ期67例；肿瘤细胞分化程度：高分化23例，中分化44例，低分化52例；病理诊断证实有淋巴结转移者84例，无淋巴结转移者35例（表1）。生存时间从术后第1天算起，截止期为2010年2月28日。另取外伤手术治疗的16例患者的肺正常组织作为对照，其中男性11例，女性5例，年龄17~55岁。

1.2 标本采集 标本离体15 min内取材，迅速分成0.5 cm×0.5 cm的小组织块置于液氮中运送至-80 ℃超低温冰箱内保存备用。

1.3 Western blot检测 HGFK1兔多克隆抗体和二抗（辣根过氧化酶标记的羊抗兔多克隆抗体），均购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL化学发光检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；PBS缓冲液粉剂购自美国Gibco公司。抽提蛋白样品使用上海碧云天生物技术有限公司生产的Western及IP细胞裂解液（P0013）裂解组织。样品经SDS-PAGE分离蛋白，湿电转移至硝酸纤维素膜上，4 ℃封闭过夜，一抗（1∶1 000稀释）室温温育，洗膜后加入二抗（1∶5 000稀释）室温温育1 h，使用BeyoECL Plus（P0018）等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒（FFC58/FFC83）进行。洗片时可以使用X光片自动洗片机［5］。

1.4 统计处理 HGFK1表达与肺癌临床病理特征之间的相关性分析用卡方、Fisher精确检验，生存分析用Kaplan-Meier曲线法和Logrank检验。所有分析均采用SPSS 10.0统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HGFK1蛋白在NSCLC组织和正常肺组织中的表达 HGFK1蛋白在肺癌组织中阳性表达27例，阳性率为22.7%；正常组织中阳性表达11例，阳性率为68.7%（图1）；两者经比较，差异有显著的统计学意义（P<0. 01）。说明HGFK1在肺癌组织中表达下调（表2）。

2.2 HGFK1蛋白在NSCLC组织表达与临床病理类型的关系 高分化组（G1）23例中阳性表达11例，阳性率47.8%；中分化组（G2）44例，中阳性表达10例，阳性率22.7%；低分化组（G3）52例中阳性表达6例，阳性率11.5%；3组之间的HGFK1阳性表达率经比较，有显著差异性（P<0.05）。HGFK1蛋白的表达随癌组织分化程度的降低而降低，说明HGFK1蛋白表达与组织分化程度有关。

2.3 HGFK1蛋白与淋巴结转移的关系 淋巴结有转移组的69例患者肺癌组织中HGFK1表达阳性为8例，阳性率为11.6%；而淋巴结无转移组的50例患者肺癌组织中HGFK1的表达阳性为19例，阳性率为38.0%。HGFK1蛋白在有淋巴结转移组患者的肺癌组织中阳性表达率明显高于无转移组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 HGFK1基因表达与无疾病进展生存时间以及总生存期的关系 HGFK1表达阳性组患者的3年无疾病进展生存（progress free survival，PFS）时间以及总生存（overall survival，OS）期均显著长于HGFK1表达阴性组患者（P值分别为0.002和0.017，图2）。

表 1 119例NSCLC患者的基本临床病理资料与HGFK1表达阳性之间的关系Tab. 1 Basic information of 119 patients with NSCLC

表 2 HGFK1在正常肺组织中和NSCLC组织中的表达情况Tab. 2 The expression of HGFK1 in normal and non-small cell lung cancer patients tissues n(%)

3 讨 论

HGFK1于2000年首次被克隆于HGF的α链，具体位于肝细胞生长因子的第一个环状结构域。HGFK1蛋白包括127~214个氨基酸残基，相对分子质量约为11×103，研究人员发现其具有强烈抑制牛动脉血管内皮细胞的作用［4］，甚至强于血管生成抑制因子（angiostatin）。最近研究发现，一方面，rAAVHGFK1具有对血管生成的强效抑制作用，可以直接作用于肿瘤血管，从而抑制肿瘤细胞的生长；另一方面，rAAV-HGFK1可在分子水平上针对EGF、VEGF、bFGF以及TGF-beta等多个靶点同时发挥作用，从而达到阻断肿瘤细胞转移的作用［5-6］。而目前现有对HGFK1在肺癌中作用的报道很少，所以研究HGFK1与肺癌临床病例因素的关系以及其在肺癌中的预后价值有一定必要。有关研究资料表明：肺癌的发生是由于癌基因激活、抑癌基因失活使细胞增殖失控所造成的［6-8］。p16、p53、c-myc、EGFR和PTEN基因中，有的是重要的抑癌基因，可直接抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，具有减慢细胞周期的作用。而抑癌基因失活或者癌基因过度表达时，可导致细胞增殖失控、凋亡减少而形成肿瘤或加快肿瘤的生长和转移［9-10］。尽管如此，NSCLC的发生、发展以及转移的机制尚未能够完全解释清楚，进一步研究和NSCLC的发生发展相关的新基因是必要的。本研究发现HGFK1蛋白在肺癌组织中阳性表达27例，阳性率为22.7%；正常组织中阳性表达11例，阳性率为68.7%；两者比较差异有显著的统计学意义（P<0.01）。这说明HGFK1在肺癌组织中表达下调。此外，HGFK1蛋白在23例高分化NSCLC患者的组织（G1）中表达的阳性率为47.8%，中分化（G2）为22.7%；而低分化（G3）为11.5%，3组之间的HGFK1阳性表达率经比较差异有统计学意义（P<0.05），HGFK1蛋白的表达随癌组织分化程度的降低而降低，说明HGFK1蛋白表达与组织分化程度有关。同时，HGFK1在有淋巴结转移组患者的肺癌组织中阳性表达率显著高于无转移组（P<0.05）；HGFK1蛋白表达阳性组的3年PFS以及OS均显著长于HGFK1蛋白表达阴性组。这些结果高度提示HGFK1蛋白和肺癌的发生、发展以及转移相关，其表达与否也显著影响着NSCLC患者的预后。因此在临床工作中对NSCLC患者行肺组织活检测定其HGFK1的表达时，对HGFK1表达阳性者，术中要高度警惕淋巴结的转移，并彻底清除相关淋巴结，术后应行放射治疗和（或）化学治疗，以减少术后淋巴结转移复发，延长患者生存时间。这对于NSCLC的早期诊断、预测生物学行为、评估预后及指导临床治疗等方面是一种很有价值的参考指标。

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Detection of HGFK1 expression and its prognostic significance of in 119 patients with non-small cell lung cancer

ZHOU Xiao-hui,YANG Yi,GAO Zong-li,FAN Li-hong,SHEN Zan,YUE Lu(Department of Pneumology, The 6th People’s Hospital of Shanghai, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)

SHEN Zan E-mail：shenzanok@yahoo.com

Background and purpose：Our preliminary research shows that HGFK1 can not only inhibit angiogenesis, but significantly inhibit tumor growth and metastasis, while the expression and clinical significance of HGFK1 in lung cancer has not been reported yet. This study aimed to explore the expression state and clinical significance of HGFK1 in the non-small cell lung cancer patients, so as to provide a new prognostic factor and a potential therapeutic target for lung cancer patients.Methods：The subjects were 119 non-small cell lung cancer(NSCLC) cases. Detected the expression of HGFK1 by Western blot in the surgical resection specimens, and further analysed the relationship between the HGFK1 expression and patients’ clinical pathophysiological characteristics and prognosis.Results：The results showed that 22.7% (27/119) of patients with lung cancer expressed HGFK1 protein,while in normal lung tissue the expression of HGFK1 was 68.7% (11/16), which was significantly higher than that of lung cancer tissue. The expression of HGFK1 gene did not associated with patient's age, gender, histological type, and smoking status (P＞0.05). The expression of HGFK1 was significantly correlated with tumor grade and lymph node metastasis. HGFK1 positive rate in tissues of patients with poor pathological grade (G3) was obviously lower (11.5%vs31.3%) compared to that of patients with relatively good pathological grade (G1, G2). While the HGFK1 positive rate in patients with lymph node metastasis tissues were obviously lower than those without lymph node metastasis(11.6%vs47.5%). 3-year progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of the group that HGFK1 was positive expressed were significantly longer than the HGFK1 negative group (Pvalue is 0.002, 0.017, respectively).Conclusion：The expression of HGFK1 gene in normal lung tissues was different from that in NSCLC patients’lung cancer tissues. Furthermore, different cancer tissues of NSCLC patients had different expression status. The patients who had the better pathological grade or without lymph node metastasis had higher HGFK1 positive rate. The expression of HGFK1 had no significant relationship with patient's gender, histological type, smoking status and other clinical features. HGFK1 expression is significantly associated to better 3 years PFS and OS remains.

non-small cell lung cancer; HGFK1 gene; prognosis

R734.2

A

1007-3639(2010)05-0353-05

国家自然科学基金资助项目（编号：30872991）；上海市浦江人才计划（编号：08PJ14073）。

沈赞 E-mail:shenzanok@yahoo.com

2010-03-26

2010-05-09）