柴银感冒颗粒抗病毒作用的研究

黄 华， 崔晓兰， 王歆君， 姚 华

（1.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐 830004;2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700;3.新疆制药厂，新疆乌鲁木齐 830032）

柴银感冒颗粒（无糖型）为卫生部部颁标准收载品种，是由柴胡、金银花、大青叶、板蓝根、陈皮、甘草等药材组成的复方制剂，具有清热解毒等功效，临床主要用于风热感冒。本文通过体内、外实验，对柴银感冒颗粒的抗病毒作用展开研究，为其在临床防治流感的应用提供参考。

1 实验材料

受试药 柴银感冒颗粒（无糖型），15 g/袋，临床成人口服 1～2袋/次，3次/日，国药准字Z20025872，由新疆制药厂提供，批号20040556;抗病毒颗粒，15 g/袋，临床成人口服1～2袋/次，3次/日，国药准字Z51020073，四川光大制药有限公司生产，批号0406027。

病毒及细胞株 甲型流感病毒（A）、乙型流感病毒（B）、柯萨奇B族病毒5型（Cox B5）、副流感病毒1型（HVJ－1）、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒3型（Ad－3），流感病毒亚甲型鼠肺适应株（FM1），分别购自中国预防医科院病毒研究所及儿科研究所。狗肾传代细胞株（MDCK），购自中国预防医学科学院病毒研究所。

实验动物 昆明种小鼠，♀♂各半，体重（14±1）g，由北京维通利华实验动物技术研究所提供，合格证 scxk（京）2002－003 号。

细胞营养液 培养液含5%小牛血清、维持液含2%小牛血清。

试剂与仪器 含谷氨酰胺的MEM培养基（美国GIBICOL公司）;DMSO、HEPES、小牛血清（中国医科院生物医学工程研究所）;L－谷氨酰胺（Sigma公司）;MTT、胰蛋白酶（Amresco公司）。

BHC－1300ⅡA/B3型生物安全柜（苏净集团）;HH.CP－01 型 CO2培养箱（上海福玛）;XDS－1B 倒置显微镜（南京翼飞）;MDF－382E型超低温冰箱（日本SANYO电器）;SZ－96自动纯水蒸馏器（上海亚荣）;DM LB/11888010型荧光显微镜（德国Leica）。

2 方法与结果［3，4］

2.1 体外实验

柴银感冒颗粒和抗病毒颗粒均以纯水配成100 mg/mL的原液，过滤除菌后备用，实验时按需要做倍比稀释。

2.1.1 测定药物对MDCK细胞的毒性

分别将原药液用维持液稀释成1∶4、1∶8、1∶16、…、1∶256共七个浓度，加到接种MDCK细胞并已长成单层的96孔培养板中，100 μL/孔，每稀释度4个复孔，同时设细胞对照。将培养板置37°C 5%CO2培养箱中培养，每日观察细胞生长情况，确定细胞不出现明显退变的最低稀释倍数为最大无毒浓度（TC0），并按 Reed－Muench法计算 50%毒性浓度（TC50），结果见表1。

表1 对MDCK细胞的TC0和TC50的测定

2.1.2 对病毒致细胞病变（CPE）的影响

取已接种MDCK细胞并长成单层的培养板，吸弃培养液，按100倍的半数组织感染剂量（TCID50）分别加入不同病毒液50 μL，置37°C 5%CO2培养箱中吸附1 h后，吸弃病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s维持液洗细胞表面2次，设细胞对照组、病毒对照组、抗病毒颗粒组和柴银颗粒不同浓度（取TC0及其以下的3个2倍稀释度共4个浓度）的给药组，4孔/组。给药组加入不同稀释度的药液，对照组加维持液，100 μL/孔。培养板置 37°C、5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，其程度按六级标准判断，并按Reed－Muench法计算IC50和SI（TC50/IC50）。

－:细胞生长正常，无病变出现;

±:细胞病变少于整个单层细胞的10%;

1:细胞病变约占整个单层细胞的10% ～25%;

2:细胞病变约占整个单层细胞的25% ～50%以下;

3:细胞病变约占整个单层细胞的50% ～75%以下;

4:细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。

结果柴银感冒颗粒对甲、乙型流感病毒、HVJ－1、Cox B5、RSV有明显的抑制作用，其 IC50分别为457.0、676.1、347.2、537.0、562.4 μg/mL，SI分别为9.8、6.6、12.8、8.3、7.9，对 Ad－3 无明显抑制作用（表2、3）。

表2 对病毒致MDCK细胞病变程度（CPE）的影响

2.2 体内实验

2.2.1 对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

表3 对病毒致MDCK细胞病变的IC50和SI

取小鼠60只，随机分为正常对照组、病毒感染对照组、抗病毒颗粒组和3个剂量的柴银感冒颗粒组，每组10只。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉后以15LD50的FM1滴鼻感染，0.05 mL/只。感染前一天开始按剂量灌胃给药，每天1次，连续5 d，对照组给予等量蒸馏水（DW）灌胃。第6天各组小鼠称重后处死解剖，摘取全肺称重，计算肺指数和肺指数抑制率。

结果3个剂量的柴银感冒颗粒肺指数值均低于病毒感染对照组，其中大剂量组对FM1引起的肺炎有明显的抑制作用（表4）。

表4 对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用（±s）

表4 对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用（±s）

与正常对照组比较，##P＜0.01;与病毒感染对照组比较，*P＜0.05，**P ＜0.01。

组别 剂量/（g/kg）动物数/只 肺指数值 抑制率/%正常对照 — 10 0.98±0.04—27.3病毒感染对照 — 10 1.50±0.34## —抗病毒颗粒 6 10 1.17±0.24* 22.0柴银感冒颗粒 3 10 1.27±0.40 15.3 6 10 1.25±0.32 16.7 12 10 1.09±0.16**

2.2.2 对流感病毒所致小鼠死亡的保护作用

取小鼠100只，随机分为病毒感染对照组、抗病毒颗粒组和三个剂量的柴银感冒颗粒组，每组20只。各给药组按剂量灌胃给药，每天1次，连续7 d，病毒对照组给予等量的蒸馏水。给药第2天各组小鼠用乙醚轻度麻醉后，FM1病毒液取感染后死亡率超过90%的浓度2LD50滴鼻感染，每只0.05 mL。记录感染后小鼠的死亡情况，计算死亡保护率及生命延长率。

结果在感染病毒后15 d内，各给药组小鼠死亡率均低于感染对照组，存活时间较感染组延长，柴银感冒颗粒中、大剂量保护作用明显，死亡保护率分别为21.1%、31.6%，生命延长率为17.8%和22.5%（表5）。

表5 对流感病毒致小鼠死亡的保护作用

2.2.3 对小鼠肺内流感病毒增殖量的影响

取小鼠50只，随机分为病毒感染组、抗病毒颗粒组和3个剂量的柴银颗粒组，每组10只。各给药组动物按剂量灌胃给药，2次/d，连续3 d。对照组给等量的蒸馏水。于给药第2天各组动物以1000LD50滴鼻感染 FM1，0.05 mL/只，48 h 后处死动物，摘取左肺中叶固定，常规脱水、包埋、制作石蜡切片，间接荧光染色，观察计数肺内荧光颗粒，判断药物对病毒增殖的影响。

结果3个剂量的柴银颗粒组肺内病毒增殖量均明显低于病毒对照组，表明柴银颗粒对小鼠肺内流感病毒的增殖有显著的抑制作用（表6）。

本实验研究结果表明，柴银感冒颗粒体外给药可抑制甲型、乙型流感病毒、副流感病毒等呼吸病毒所导致的细胞病变;对流感病毒感染小鼠有明显的保护作用，可降低死亡率并延长小鼠生存期;对小鼠流感病毒性肺炎有明显的抑制作用，并可抑制小鼠肺内流感病毒的增殖。

表6 柴银颗粒对小鼠肺内流感病毒增殖量的影响（±s）

表6 柴银颗粒对小鼠肺内流感病毒增殖量的影响（±s）

与病毒感染对照组比较，**P＜0.01。

组别 剂量/（g/kg） 终样本数/动物数/只 检查总数/个 阳性数/个 阳性率/% 抑制率/%病毒感染对照 —9/10 238 101 41.8±8.5 0抗病毒颗粒 6 9/10 218 50 22.9±6.2** 45.3柴银感冒颗粒 3 9/10 234 62 30.7±6.4** 26.7 6 9/10 214 60 28.9±9.3** 32.5 12 9/10 228 70 26.2±5.8**37.5

3 讨论

传统中药在防治流感方面有其独道之处，许多解表药、清热药和以它们为主组方的中成药可通过抗病毒、免疫调节、解热抗炎等途径起到抗流感作用［1］。如单味药中，柴胡的水提液及挥发油对流感病毒有显著的抑制作用［1，2］;金银花水提液可抑制流感病毒致细胞病变作用［1，2］，降低流感病毒感染小鼠的死亡率，并降低鼠肺中病毒血凝素的效价［1］;板蓝根水提液在体外鸡胚试验中可抑制流感病毒的增殖，并抑制流感病毒致人胚肾原代细胞的病变［1，2］。这些单味药经过配伍或组成复方后，抗病毒范围可能互补、扩大甚至协同［1］。本文对柴银感冒颗粒的研究证实该复方制剂对流感病毒等多种呼吸道病毒均有良好的抗病毒作用，为其在临床用于防治病毒性感冒提供了实验依据。

［1］李艳华，于康震，佟恒敏，等.中药抗流感病毒研究概况［J］.中国兽医杂志，2003，39（6）:35－37.

［2］马振亚.中药抗病毒抗菌作用研究［M］.北京:中国医药科技出版社，2005:74，79，91.

［3］陈鸿珊，张兴权，陶佩珍，等.抗病毒药物及其研究方法［M］.北京:化学工业出版社，2006:6.

［4］黄祯祥，洪 涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术［M］.北京:科学出版社，1990:2.