纤维黏连蛋白碎片增加整合素α5β1在髓核细胞表达的研究

夏茂盛，朱悦，高静杰

（1.中国医科大学 附属第一医院骨科，沈阳 110001；2.辽河油田第二职工医院 麻醉科，辽宁 盘锦 124010）

纤维黏连蛋白（fibronectin）是一种间盘细胞外基质糖蛋白，可以被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP） 分解为纤维黏连蛋白碎片（fibronectin fragments，Fn-f）［1］。在间盘退变过程中，Fnf是一种退变的产物，其含量明显增加。同时研究表明，Fn-f又具有诱导间盘退变的作用［2］。将Fn-f注入髓核内，间盘出现了退变样改变；将Fn-f加入间盘细胞的培养液，间盘细胞基质蛋白的合成明显减少，而 MMP 的表达明显增加［3，4］。然而目前 Fn-f诱导间盘退变的具体机制并不清楚。而纤维黏连蛋白和 Fn-f在细胞膜上主要的受体是整合素 α5β1［5，6］。因此，本实验将Fn-f加入髓核细胞的培养液，观察Fn-f对其受体整合素α5和β1亚基表达的影响，探讨Fn-f诱导间盘退变的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

动物为日本大耳白兔，3月龄，10只，体质量（2 500±200）g；试剂为纤维黏连蛋白碎片（110 kDa，Sigma）、用于免疫沉淀的整合素α5和β1亚基抗体和蛋白G琼脂糖小球（upstate biotechnology）、用于Western blot和免疫荧光的鼠抗整合素 α5、β1、II型胶原蛋白、MMP9和MMP13的单克隆抗体（SantaCruz）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离和培养：无菌取出兔间盘髓核组织，0.2%的胶原酶消化4 h，用D-Hanks进行酶液清洗3次。然后用培养液DMEM/F12+15%胎牛血清重悬细胞，以2×104/cm2接种于培养皿内，置于37℃5%CO2条件下培养。约6～7 d后，待细胞贴壁完全第1次换液，以后隔2～3 d换液，细胞生长到80%融合后，用0.25%胰酶消化传代。第3代细胞长到70%～80%融合后，将培养液去除，实验组加入含有Fn-f的无血清DMEM/F12培养液，Fn-f的浓度为100nmol/L，对照组则只加入无血清DMEM/F12培养液，37℃5%CO2条件下培养2 d。

1.2.2 Western免疫印迹：培养2 d后，去除培养液，加入裂解液，收集细胞裂解液，用Bradford法测各个样品蛋白含量。比较两组间整合素α5和β1含量，取实验组和对照组样品各1 000μg加入8μg抗-整合素亚型（α5或 β1）的抗体，4 °C 孵育 12 h。然后向样品中加入200μl蛋白G琼脂糖小球，4°C孵育2 h。离心（14 000 g，5 s）收集琼脂糖小球，并在沸水中煮5 min。取上清加入准备好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离样品。而比较II型胶原蛋白、MMP9、MMP13在两组间含量时，样品蛋白含量定量后，每组样品取的蛋白量一致，均为50μg，直接将样品加入准备好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离样品。以后实验步骤相同，电泳分离样品后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。封闭后，在膜上分别加入鼠整合素亚型 （α5、β1）、II型胶原蛋白、MMP9 和MMP13的特异性一抗，1∶1 000稀释，孵育2 h。洗膜1 h后，加入羊抗鼠的二抗，辣根过氧化物酶标记，1∶2 000稀释，孵育2 h。最后纤维素膜用ECL底物显影到胶片上，以β-actin为内参，结果用图像分析软件进行分析。

1.2.3 免疫荧光：细胞培养2 d以后，将培养液倒出，用PBS稍洗细胞，然后在-20°C条件下用纯甲醇固定6 min。固定后的细胞经PBS稍洗细胞后，封闭30 min，然后加入一抗，鼠抗兔的针对整合素α5亚基和Ⅱ型胶原蛋白的一抗同时加入，针对整合素β1亚基和Ⅱ型胶原蛋白的一抗同时加入，4°C过夜。洗去一抗后，加入TRITC和FITC结合的二抗，室温2 h。然后PBS洗细胞30 min，甘油封片，荧光显微镜观察结果。

1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：将细胞裂解后，应用Trizol等提取总核糖核酸（RNA）。用TAKARA试剂盒，将提取的RNA逆转录为cDNA，再进行PCR扩增，引物见表1。反应条件是94℃2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 35 个循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，分离PCR扩增产物。经紫外分光仪比较PCR产物的含量。

1.3 统计学分析

实验结果利用SPSS12.0统计软件进行分析，多样本采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 用于RT-PCR的引物序列Tab.1 The sequences of the primers used for RT-PCR

2 结果

2.1 细胞形态的变化

加入Fn-f后髓核细胞形态变化明显，细胞体积缩小，有多角形转变为细长形，并可见少量细胞碎裂，细胞内和细胞间颗粒样物质明显增多（图1）。

2.2 蛋白表达的变化

经Fn-f作用后，整合素 α5、β1亚基和MMP9、MMP13的含量都明显增加，与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）。而Ⅱ型胶原蛋白的含量明显下降，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。免疫荧光技术观察到整合素α5、β1均表达在细胞膜上，经Fn-f作用后，这两种蛋白在胞膜上的荧光强度明显增强，而Ⅱ型胶原蛋白的荧光强度明显降低（图 2）。

2.3 基因表达的变化

经 Fn-f作用后，整合素 α5、β1亚基、MMP9、MMP13的表达均明显升高，而Ⅱ型胶原蛋白的表达明显降低（图3）。

3 讨论

表2 两组整合素α5、β1亚基、MMP9、MMP13和II型胶原蛋白含量的比较Tab.2 The comparison of integrinα5,β1 subunits,MMP9,MMP13 and collegen IIprotein content

本实验发现，Fn-f可以诱导间盘髓核细胞退变。在加入Fn-f后，髓核细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达降低，而MMP9和MMP13的表达明显升高。在Fn-f的干预下，整合素α5β1的表达增加，这说明Fn-f有促进其受体表达增加的作用。

Fn-f是间盘退变过程中纤维黏连蛋白的分解产物，在退变间盘内的含量明显增加［8］。究其原因有两方面，一方面是纤维黏连蛋白在退变间盘内的表达增多［9，10］，另一方面在退变过程中MMP的表达明显增加，而正是MMP将纤维黏连蛋白分解为Fn-f［11］。体内和体外实验都证明了Fn-f有减少糖蛋白表达，促进基质蛋白分解的作用［2～4］。本实验同样证明了这个结论，Fn-f减少了II型胶原蛋白的表达，增加了MMP9和MMP13的表达。但Fn-f诱导间盘退变的具体机制并不清楚。而Fn-f同样有诱导软骨退变的作用，发现Fn-f在软骨细胞膜上的受体是整合素 α5β1［12，13］，并且 Fn-f有增加整合素 α5和 β1亚基表达的作用［14］。整合素α5和β1亚基在间盘内同样有表达［7］，而且整合素α5β1是纤维黏连蛋白和Fn-f在间盘细胞膜上主要的受体［5］。因此，本实验研究了在Fn-f作用下的髓核细胞整合素α5和β1亚基的表达情况，发现α5和β1亚基表达明显增加。

研究Fn-f的退变机制时，Homandberg提出Fn-f的作用由Fn-f、MMP、纤维黏连蛋白、II型胶原蛋白组成的正反馈恶性循环，即Fn-f增加了MMP的表达，增加的MMP分解纤维黏连蛋白形成更多的Fnf，而II型胶原蛋白的表达减少是这个恶性循环的最终结局［15］，本实验结果与这个理论一致。本研究同样发现Fn-f有促进整合素α5、β1亚基表达作用。由于整合素α5β1在Fn-f诱导间盘退变过程中起到了膜受体的作用，而Fn-f又有促进其受体表达增加的作用，那么可以将整合素α5β1纳入这个正反馈恶性循环，即Fn-f与髓核细胞膜上的整合素α5β1结合后，影响了髓核细胞的代谢，MMP和受体整合素α5β1的表达都增加，MMP分解纤维黏连蛋白使Fn-f的量增加，而整合素α5β1表达的增加使Fn-f的结合位点增多，促进了Fn-f诱导髓核细胞退变的作用。因此，整合素α5β1既是Fn-f在间盘细胞上的受体，同时又是Fn-f诱导间盘退变的正反馈恶性循环中的关键环节。

综上，本实验测定了Fn-f对于间盘髓核细胞的影响，初步探讨了Fn-f对于间盘整合素α5β1表达的影响。但由于本实验只是体外培养环境下进行的研究，体内环境下Fn-f诱导间盘退变的机制有待进一步的研究。

［1］Omlor GW，Lorenz H，Engelleiter K，et al.Changes in gene expression and protein distribution at different stages of mechanically induced disc degeneration——an in vivo study on the New Zealand whiterabbit［J］.JOrthop Res，2006，24（3）：385-392.

［2］Aota Y，An HS，Homandberg G，etal.Differential effectsof fibronectin fragment on proteoglycan metabolism by intervertebral disc cells：a comparison with articular chondrocytes［J］.Spine，2005，30（7）：722-728.

［3］Greg Anderson D，Li X，Tannoury T，et al.A fibronectin fragment stimulates intervertebral disc degeneration in vivo［J］.Spine，2003，28（20）：2338-2345.

［4］Anderson DG，Li X，Balian G.A fibronectin fragment alters the metabolismbyrabbitintervertebraldisccellsinvitro［J］.Spine，2005，30（11）：1242-1246.

［5］Gilchrist CL，Chen J，Richardson WJ，et al.Functional integrin subunitsregulatingcell-matrix interactionsin theintervertebral disc［J］.JOrthop Res，2007，25（6）：829-840.

［6］Homandberg GA，Costa V，Ummadi V，etal.Antisenseoligonucleotides totheintegrin receptor subunit alpha（5）decreasefibronectin fragmentmediatedcartilagechondrolysis［J］.OsteoarthritisCartilage，2002，10（5）：381-393.

［7］Nettles DL，Richardson WJ，Setton LA.Integrin expression in cells of theintervertebral disc［J］.JAnat，2004，204（6）：515-520.

［8］Oegema TRJr，Johnson SL，Aguiar DJ，et al.Fibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc［J］.Spine，2000，25（21）：2742-2747.

［9］Omlor GW，Lorenz H，Engelleiter K，et al.Changes in gene expression and protein distribution at different stages of mechanically induced disc degeneration--an in vivo study on the New Zealand white rabbit［J］.JOrthop Res，2006，24（3）：385-392.

［10］Nerlich AG，Bachmeier BE，Boos N.Expression of fibronectin and TGF-beta1 mRNA and protein suggest altered regulation of extracellularmatrixindegenerateddisctissue［J］.Eur SpineJ，2005，14（1）：17-26.

［11］Hsu CC，Lai SC.Matrix metalloproteinase-2，-9 and-13 are involved in fibronectin degradation of rat lung granulomatous fibrosis caused by angiostrongyluscantonensis［J］.Int JExp Pathol，2007，88（6）：437-443.

［12］Homandberg GA，Costa V，Wen C.Fibronectin fragments active in chondrocytic chondrolysis can be chemically cross-linked to the alpha5 integrin receptor subunit［J］.Osteoarthritis Cartilage，2002，10（12）：938-949.

［13］Forsyth CB，Pulai J，Loeser RF.Fibronectin fragments and blocking antibodies to alpha2 beta1 and alpha5beta1 integrins stimulate mitogen-activated protein kinase signaling and increase collagenase 3（matrix metalloproteinase 13）production by human articular chondrocytes［J］.Arthritis Rheum，2002，46（9）：2368-2376.

［14］Takahashi I，Onodera K，Sasano Y，et al.Effect of stretchingon gene expression of beta1 integrin and focal adhesion kinase and on chondrogenesisthroughcell-extracellularmatrixinteractions［J］.Eur JCell Biol，2003，82（4）：182-192.

［15］Homandberg GA.Potential regulation of cartilagemetabolismin osteoarthritisbyfibronectinfragments［J］.Front Biosci，1999，4：D713-730.