一种细胞核质蛋白分离方法的建立

徐小燕，杨雪，夏蒲，邢亚楠，关一夫，郑华川

（中国医科大学 1.基础医学院生物化学与分子生物学教研室；2.基础医学院病理生理学教研室；3.附属第一医院肿瘤外科，沈阳110001）

随着蛋白质组学的发展，确定蛋白质在细胞内定位的的重要性日益彰显。在研究细胞不同组份的时候，细胞核和细胞质这两个细胞组份最受关注，这就要求研究者对细胞的核、质蛋白进行有效的分离提取，从而可以将分离出来的核蛋白用于转录调控方面的研究，降低蛋白表达的背景噪声，为蛋白功能研究奠定实验基础［1］。本研究利用培养的癌细胞系，建立了一种比较经济、便捷的细胞核质蛋白分离方法，约90 min就可以完成培养细胞的细胞核蛋白和质蛋白的分离。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640、MEM、DMEM 和 Ham F12购自海克隆生物化学制品有限公司，胎牛血清、青霉素和链霉素购自 Thermo公司，一抗 Bag-1、GRP78、parafibromin、lamin B以及β-actin购自Santa Cruz公司，抗ING5抗体购自Proteintech公司，HRP连接的二抗IgG购自DAKO公司，Thermo NE-PER誖Nuclear and Cytoplasmic Extraction试剂盒购自 Thermo公司，Ambion PARISTM试剂盒购自Ambion公司。胃癌细 胞 系 MKN28、MKN45、 KATOIII、HGC-27、GT-3TKB 和 AGS，肺癌细胞系 H-446、H-460、MS-1、PC14、AoI和SQ-5分别由神奈川癌中心高野康雄教授馈赠。

RLN裂解液（配方来自Qiagen公司的RNeasy誖Mini试剂盒）的主要成分为50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2和 0.5%Nonidet P-40（1.06 g/ml）。RIPA裂解液的主要成分为 50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1%SDS和1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。蛋白酶抑制剂的主要成分为苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、抑肽酶（aprotinin）、亮抑酶肽（leupeptin）和抑肽素（pepstain A）。

1.2 细胞培养

分别使用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素 、100 mg/L 链 霉 素 的 RPMI 1640（MKN28、MKN45、 KATOIII、H-446、H-460、MS-1 和 PC14)、MEM（HGC-27、AoI 和 SQ-5)、DMEM（GT-3TKB)和Ham F12（AGS)培养基在 37 ℃、5%CO2、饱和湿度的环境下培养癌细胞。

1.3 利用Ambion PARISTM试剂盒进行核质蛋白分离提取

收集1×107个新鲜培养的细胞，用PBS洗1次，冰上放置。冰上预冷的100～500μl的细胞分离缓冲液重悬细胞，冰上静置5～10 min。4℃条件下500 g离心样品1～5 min，小心吸取胞质成分。冰上预冷的细胞分离缓冲液清洗核沉淀。细胞破碎缓冲液裂解核沉淀后收集核蛋白。

1.4 利用 Thermo NE-PER誖Nuclear and Cytoplasmic Extraction试剂盒进行蛋白提取

按照说明书操作，收集细胞，PBS洗2遍，加入收集细胞10倍体积的细胞质蛋白抽提试剂A，涡旋仪涡旋5 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰上静置10～15 min。加入细胞体积一半的细胞质蛋白抽提试剂B，涡旋5 s，冰上静置5 min，涡旋5 s，4℃条件下12 000~16 000 g离心5 min，立即吸取上清，抽提得到的即为细胞质蛋白。完全吸尽残余上清，向沉淀加入2.5倍体积的细胞核蛋白抽提试剂B，涡旋15～30 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再高速剧烈涡旋15～30 s，共30 min。4℃条件下15 000 g离心10 min，立即吸取上清，抽提得到的即为细胞核蛋白。

1.5 本实验室建立的核蛋白提取方法

收集2×107个细胞，用细胞体积3～4倍的RLN裂解液 （含 8.5%PMSF、0.1%Aprotinin、0.1%Leupeptin和0.035%Pepstain A蛋白酶抑制剂），冰上静置20 min。4℃条件下3 000 g离心10 min，提取上清。加入原收集细胞4倍体积的RLN裂解液，吹打混匀，洗核沉淀。4℃条件下3 000 g离心10 min。彻底弃掉上清，加入RIPA裂解液100μl，在需要加入RIPA裂解液前数分钟内加入上述蛋白酶抑制剂。吹打混匀后，冰上静置10 min。冰浴超声工作5 s，间歇5 s，共3次。4℃条件下12 000 g离心20 min。提取上清即为所需的核蛋白。

1.6 Western blot

将收集的细胞按照上述3种方法提取胞质蛋白和核蛋白后，采用Bradford法测定提取液中的蛋白浓度。各取50μg蛋白定量上样，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压80 V，分离胶电压110 V，150 mA电流半干转膜120 min。用含5%脱脂奶粉的封闭液于室温下摇动封闭1 h，分别加入一抗Bag-1（1∶500稀释）、GRP78（1∶500稀释）、ING5（1∶500稀释）、parafibromin（1∶100 稀释）、lamin B（1∶1 000稀释）和β-actin（1∶1 000稀释），4℃过夜。室温下加入二抗（1∶5 000稀释）孵育2 h。TBST洗膜，ECL法显色，暗室中压片、显影、定影。

2 结果

利用Thermo的试剂盒提取核质蛋白后进行Western blot检测，结果如图1所示，在MKN28等5种胃癌细胞系中，36 kDa Bag-1存在于 MKN28、AGS、MKN45和 KATO-Ⅲ的胞质中，32 kDa异构体存在于HGC27细胞质中，β-actin为质蛋白检测的内参。虽然在AGS和HGC-27细胞核蛋白中有内质网的标志性蛋白GRP78出现，但32 kDa和36 kDa异构体在AGS细胞核中、50 kDa异构体在HGC27细胞核中呈强表达。

利用Ambion的试剂盒提取核质蛋白后进行Western blot检测，结果如图2所示，在MKN28等5种胃癌细胞系中，ING5蛋白主要在细胞核中表达。我们用质蛋白内参β-actin标记核蛋白的污染程度，结果发现其在核内表达极少。ING5蛋白在细胞质里有少量表达，但是我们通过免疫组化方法已经确认了这种表达来自于核蛋白污染。

利用本实验室自建的方法提取核质蛋白后进行Western blot检测，结果如图3所示，在H-446等6种肺癌细胞系中，parafibromin主要是在6种肺癌细胞系的细胞核中表达。虽然PC-14和AoI两种细胞的细胞质中有parafibromin表达，其表达水平与核蛋白内参lamin B表达一致，提示可能是核蛋白污染所致。β-actin在细胞质中高表达，在核成分中低表达，lamin B在胞核成分中高表达，在胞质中低表达，说明本实验室此次分离抽提的核质蛋白较成功。

3 讨论

本研究室自建的方法中，首先使用仅含有非离子表面活性剂Nonidet P-40的RLN裂解液，在不破碎核的前提下，通过破坏细胞膜释放质蛋白，然后使用含有阴离子表面活性剂SDS和脱氧胆酸钠以及非离子型Triton X-100的强RIPA裂解液，配合超声破碎核膜并粉碎DNA长片段。为避免两组分污染，吸取含胞质成分的上清时不能剧烈过度抽吸，底部最好保留一些上清，然后把残余的上清液轻轻抽取后弃掉并用RLN裂解液洗涤。此外，我们还可以通过RIPA裂解液的高离子强度和渗透压来加速核膜破裂，提高核蛋白的提取率［2，3］。值得注意的是裂解液应于4℃保存，使用时置于冰上并加入蛋白酶抑制剂。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在，提取超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

内参蛋白一般指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，选择的内参一般与检测目的蛋白的分子量相差5 kDa以上。Western blot实验中内参检测不但可校正蛋白质定量和上样过程中的实验误差，也可检测Western blot操作系统是否正常。常用的细胞质蛋白内参有：细胞骨架蛋白β-actin、β-tubulin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）；常用的核蛋白内参有：组蛋白H（histone H）、核纤层蛋白（nuclear lamina protein）、K70、K80、Lamin A和B等［4，5］。本研究中选择β-actin作为胞质蛋白定量内参，内质网的标志性蛋白GRP78和β-actin作为细胞质蛋白污染内参［6］，Lamin B作为胞核蛋白定量和污染内参。本研究结果显示，利用Thermo试剂盒抽提的核蛋白中有内质网的标志性蛋白GRP78出现，说明有轻微的质蛋白污染；利用Ambion试剂盒抽提的核蛋白中用胞质蛋白的内参β-actin的抗体检测，β-actin的表达极低，说明此次核质蛋白分离的较成功，核蛋白中质蛋白污染少；而分别在利用本研究室自建的方法抽提的细胞核蛋白和质蛋白中使用胞质蛋白内参β-actin和胞核蛋白内参Lamin B的抗体进行检测，胞质蛋白中β-actin丰富表达，Lamin B微弱表达，胞核蛋白中Lamin B高表达，β-actin微弱表达。因此，可用胞核蛋白内参检测胞质蛋白中是否混入细胞核组分，可用质蛋白内参检测胞核蛋白中是否污染。

本研究室自建的方法与试剂盒相比，操作方法简单，仅需自行配置RLN和RIPA两种裂解液，各成分均为实验室常规使用的试剂，而且价格仅是试剂盒价格的百分之一，裂解液配制后冷藏存放，可随取随用，为实验节省大量开支，具有在实验室中推广使用的价值。

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［3］徐小燕，夏蒲，邢亚楠，等.冻结破碎法提取组织蛋白方法初探［J］.中国医科大学学报，2010，39（5）：336-339.

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［6］郑华川，张鸿，关一夫，等.CCl4诱发galectin-3基因敲除小鼠肝损伤中GRP78和BAD表达 ［J］.中国医科大学学报，2008，15（9）：652-654.