12例化生性乳腺癌临床病理分析

张斌斌， 李 青

乳腺癌是一组包含显著多样性的恶性肿瘤。最近的研究表明，根据基因芯片表达谱的不同，乳腺癌可分为5种分子表型:基底样型、管腔A型、管腔B型、HER2(人表皮生长因子受体2)过表达型和正常乳腺样型［1-3］。就生物学行为来看，基底样型和HER2过表达型比管腔表型和正常乳腺样表型更具侵袭性［2，4-5］。Nielsen 等［2］提出了一个包括 ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)、EGFR(表皮生长因子受体)、HER2和CK5/6(细胞角蛋白5/6)5种抗体在内的免疫组化套餐，用于对乳腺癌的基因表型进行诊断和鉴别诊断。化生性乳腺癌常包含多种异质性成分，如肉瘤样成分、鳞癌或差分化癌、梭形细胞癌、良性间叶成分及坏死组织等。据文献报道［6-8］，大约5%的乳腺癌的预后因素并不清楚。根据免疫组化表达谱分析，化生性乳腺癌细胞具有肌上皮样分化的特征［9-10］。但关于化生性乳腺癌的临床病理特征仍然不是很清楚。因此我们对12例化生性乳腺癌中 ER、PR、HER2、EGFR、CK5/6、CK14(细胞角蛋白14)和P63的表达进行了系统研究，并对其临床病理特征进行回顾性分析。同时还对化生性乳腺癌组织进行荧光原位杂交实验及电镜检查，同时还进行生存分析，以期阐明化生性乳腺癌与基底样乳腺癌的关系及其临床意义。

1 资料和方法

1.1 标本选择和临床病理参数分析 收集昆山市中医院和南京市妇幼保健院病理科2004年7月至2009年12月间化生性乳腺癌标本共12例。所有标本均经中性福尔马林固定后石蜡包埋。HE染色切片由两位高年资病理医生诊断。组织学分级采用Bloom-Richardson分级标准［11-12］。临床病理参数包括初始病理诊断、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学亚型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤复发和远端转移、手术类型、激素治疗、化疗、放疗和生存时间。

1.2 免疫组织化学 标本采用4%的甲醛固定，石蜡切片，行HE染色，光镜观察。免疫组化采用En-Vision二步法，高温高压抗原修复，DAB-H2O2显色。第一抗体为 ER、PR、HER2、CK5/6、CK14、P63和 EGFR。ER、PR 购自 Thermo公司，HER2、EGFR购自DAKO公司，CK5/6购自Zymed公司，CK14购自迈新公司，P63购自Neomarkers公司。免疫组化结果判断:细胞核、胞质或细胞膜上棕黄色颗粒为阳性着色。按标本中阳性细胞百分比分别计为－、+、++、+++4个等级，不着色为 －，0～25%为 +，25% ～50%为++，＞50%为+++。

1.3 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) HER2基因扩增检测采用FISH方法。HER2基因探针位于17号染色体17q11.2-q12，对照探针位于17号染色体17p11.1-q11.1。切片的准备和杂交实验按照FISH试剂盒(DAKO公司)说明书进行。每一张组织切片计数30个肿瘤细胞核红色HER2信号和绿色CEN17(17号染色体着丝粒)信号，并计算HER2/CEN-17的比值(Ratio)。如果HER2/CEN-17 Ratio＞2.2则认为HER2基因扩增。如果Ratio＜1.8则认为无HER2基因扩增。如果Ratio介于1.8和2.2之间，增加计数30个细胞核信号并重新计算HER2/CEN17比值。

1.4 电镜观察 新鲜肿瘤组织，2.5%冷戊二醛固定，4℃过夜，0.1 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗 1 h，1%锇酸固定1 h，丙酮梯度脱水后，Epon812树脂包埋，制成70 nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，应用JEM-1011透射电镜观察。

1.5 统计学处理 统计方法采用方差分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法和Cox回归。P＜0.05具有统计学意义;P＜0.01具有高度统计学意义。统计软件采用SPSS16.0。

2 结果

2.1 临床病理特点 12例化生性乳腺癌患者皆为女性。平均年龄为54岁(38～82岁)。4例为绝经前、8例为绝经后患者。组织学诊断，6例为上皮亚型(4例鳞癌，2例为腺鳞癌)，4例为上皮和间叶双向分化亚型(3例癌伴软骨样化生，1例癌伴骨样化生)，2例为单向梭形细胞癌。形态学上，鳞状细胞癌呈现小片状分布，部分呈囊状，内衬鳞状上皮，细胞具有异型性，可见细胞角化。腺鳞癌由成型的腺管形成区和散在分布的实性鳞状上皮巢团混合组成。伴梭形细胞化生者表现为肿瘤细胞呈梭形，浸润至间质中呈不规则分布(图1A、B)。癌伴软骨化生和骨化生表现为浸润性乳腺癌成分中分别混有良性和恶性分化的软骨和骨(图1C)。

图1 化生性乳腺癌的形态学 A:梭形细胞化生乳腺癌(HE染色，×400)B:梭形细胞化生乳腺癌间质浸润(HE染色，×400)C:化生性乳腺癌具有恶性软骨样化生和良性的骨样化生(HE染色，×400)

X线钼靶检查显示乳腺腺体呈混合型，腺体结构紊乱，肿瘤结节边缘模糊，可见毛刺样改变(图2A)。肿瘤大小平均为 3.45(1.7 ～4.6)cm，其中只有1例肿瘤直径小于2 cm，其余皆大于2 cm。12例皆有腋窝淋巴结转移，3例有1～3枚淋巴结转移，另9例有4～7枚淋巴结转移。组织学分级均为Ⅲ级。TNM分期Ⅱ期3例，Ⅲ期9例。12例均实施了乳腺癌改良根治术，并接受了化疗(taxotere and adriamycin and cyclophosphamide，TAC)、激素治疗和放疗(见表1)。

表1 12例化生性乳腺癌的临床病理特点和治疗、随访情况

2.2 FISH实验结果 FISH检测结果示肿瘤细胞HER2基因呈红色信号，CEN17呈绿色信号。12例HER2/CEN17 Ratio均＜1.8。FISH检测结果示化生性乳腺癌中无HER2基因扩增(图2B)。

2.3 超微结构观察 透射电镜实验结果示所有化生性乳腺癌癌细胞超微结构有相似之处。具有腺鳞癌化生的化生性乳腺癌胞浆内细胞器丰富，可见张力原纤维(图2C)，细胞间可见较多的密体(图2D)。具有梭形细胞化生的化生性乳腺癌胞浆内可见细肌丝和密体(图2D)。

2.4 免疫组化实验结果 免疫组化实验结果示12例化生性乳腺癌ER、PR、HER2免疫组化反应阴性，CK5/6(图3A)和CK14(图3B)胞浆阳性率为100%(12/12)和75.0%(9/12)，EGFR(图3C)胞膜阳性率为 83.3%(10/12)，P63(图 3D)胞核阳性率为66.7%(8/12)，详细结果见表 2。

图2 化生性乳腺癌X线钼靶和FISH及透射电镜观察结果 A:X线钼靶检测示乳腺左外上象限两个结节B:FISH实验示无HER2基因扩增(×400)C:透射电镜示胞浆内的张力原纤维丝(红色箭头)D:透射电镜示胞浆内细肌丝(红色箭头)和密体(绿色箭头)

图3 免疫组化实验结果 A、B:瘤细胞示CK5/6(A，×400)和CK14(B，×400)胞浆阳性C:瘤细胞示EGFR胞膜阳性(×400)D:瘤细胞示P63核阳性(×400)

表2 12例化生性乳腺癌免疫组化实验结果

2.5 统计学分析结果 方差分析结果显示CK5/6、CK14、P63和EGFR免疫组化阳性细胞百分比之间的差异具有显著统计学意义(F=8.080，P=0.000)。多重比较分析发现CK5/6和CK14之间(P=0.003)及 CK5/6 和 P63 之间(P=0.000)的阳性表达差异有显著统计学意义，而CK5/6和EGFR之间的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果示≤54岁年龄组与＞54岁年龄组的生存率差异具有统计学意义(χ2=3.898，P=0.048)(图4A)，淋巴结转移数≤3和＞3两组之间生存率差异具有显著的统计学意义(χ2=9.156，P=0.002)(图4B)。Cox回归生存分析结果显示12例化生性乳腺癌皆可进入分析，其中11例随访至今仍存活，1例死亡，存活率为91.7%，年龄变量和淋巴结转移数变量与化生性乳腺癌的生存相关(χ2=10.835，P=0.004)。

图4 生存分析实验结果 A:Kaplan-Meier生存分析示≤54岁和＞54两者之间有统计学差异(P＜0.05)B:Kaplan-Meier生存分析示淋巴结转移≤3和＞3两组之间有显著统计学差异(P＜0.01)

3 讨论

免疫组化结果显示，12例患者ER、PR和HER2皆为阴性，即所谓的“三阴性”［13-15］，并且FISH检测也显示HER2/CEN-17 Ratio均＜1.8，进一步证实了化生性乳腺癌内无HER2基因扩增。此外，CK5/6(100%)和EGFR(83.3%)免疫染色阳性，据此我们可以认为化生性乳腺癌为基底样表型。CK14(75.0%阳性)和P63(66.7%阳性)为基底/肌上皮标记物，其阳性进一步表明化生性乳腺癌的癌细胞是向基底/肌上皮方向分化，在其分化过程中可形成癌和肉瘤样转化。Reis-Filho等［16］的研究表明，不论化生的具体成分如何，化生性乳腺癌均表现为基底样表型。在其研究中，CK5/6、CK14、EGFR和P63免疫反应阳性率低于我们的实验组，可能是其实验样本量(63例)多于本实验组所致。此外，他们只对实验中3例HER2蛋白表达阳性的病例进行了FISH实验，可能也是影响其实验结果的原因之一。而在我们的研究中，12例患者皆进行了FISH实验检测HER2基因扩增情况，因此我们的实验结果在某种程度上更为可靠合理。

超微结构观察结果显示，癌细胞胞浆内可见张力原纤维、桥粒、细肌丝和密体。在Yang等［17］的化生性乳腺癌研究中，电镜下在癌细胞胞浆中可见张力原纤维丝，在横纹肌肉瘤细胞中可见肌小节和细肌丝，其研究结果与我们相似。这些结果均为化生性乳腺癌向基底/肌上皮方向分化提供了一定证据。

方差分析结果显示CK5/6、CK14、P63和EGFR免疫组化阳性细胞百分比与化生性乳腺癌诊断具有显著相关性，其中CK5/6在诊断化生性乳腺癌时比CK14和P63更敏感。生存分析结果显示年龄和淋巴结转移与化生性乳腺癌的预后显著相关，而肿瘤部位、组织学亚型、组织学分级、肿瘤大小和TNM分期与化生性乳腺癌的预后无明显相关性。Cox回归生存函数结果显示，随着时间的延长，化生性乳腺癌的生存率逐渐降低，22个月时，生存率几乎为零(图5A)。Cox回归风险函数结果显示，随着时间的延长，化生性乳腺癌的死亡风险越来越高，25个月时，其死亡风险是初始阶段的7.5倍(图5B)。Cox回归函数方程显示，年龄越小，淋巴结转移数越少，其生存率越高。

Abd El-Rehim等［18］研究表明，基底样标记物的表达与化生性乳腺癌的预后显著相关。Rakha等［19］研究结果显示组织学分级Ⅲ级与预后有相关性。Podetta等［20］的研究结果显示，化生性乳腺癌的预后与CK5/6不相关，而与ER缺失和cyclin E表达相关。虽然许多学者研究了基底样乳腺癌的预后相关因素，但确切预后相关因素仍然不是很清楚，有待进一步研究。

我们的研究结果表明化生性乳腺癌实际上是基底样乳腺癌亚型。CK5/6、CK14、P63和EGFR可作为化生性乳腺癌的诊断标记物，而在化生性乳腺癌的诊断和鉴别诊断中，CK5/6比CK14和P63更为敏感。化生性乳腺癌的预后与年龄和淋巴结转移高度相关。本组研究样本量较少，有可能对实验结果有所影响。因此，化生性乳腺癌的确切临床病理特征仍然需要我们不断深入研究，尤其需要大样本量的回顾总结。

图5 Cox回归实验结果 A:Cox回归生存函数实验结果显示年龄和淋巴结转移与化生性乳腺癌预后相关(P＜0.01)B:Cox回归风险函数实验结果示化生性乳腺癌患者术后25个月时死亡风险最高，其死亡风险是初始阶段的7.5倍

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