黄麻染色体制备若干方法比较研究

陈 涛，徐建堂，陈燕萍，陈富成，祁建民

（福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州 350002）

黄麻（jute）为椴树科（Tiliaceace）黄麻属（Corchorus）一年生韧皮纤维作物，是世界上最重要的纤维作物之一，也是我国重要的特色经济作物。黄麻纤维具有产量高、纤维质地柔软、易染色、抗静电、抑菌、可降解等优良特点[1][2]。作为遗传物质的载体，染色体在植物种类鉴定、系统分类、遗传学、进化和迁移等相关研究中起重要作用[3]，且能够为深入探讨植物的起源、染色体水平的遗传变异及其进化机制等提供科学依据[4]，因此获得清晰的黄麻中期染色体图像，是进行黄麻核型分析等研究的关键。国内外有关黄麻属染色体和核型系统分析的报道较少，Banerjee等首先报道了黄麻属圆果种（C.capsularis L.）、长果种（C.olitoritus L.）和C.acutangulus这三个种的单倍染色体数为7[5]，黄麻染色体很小，属于小染色体类[6]，对制片要求较高。随着细胞生物学技术的发展，本研究以圆果黄麻179为材料，比较了不同预处理条件下去壁低渗涂片法、去壁低渗悬液法、预先固定去壁低渗涂片法、不同酸解时间下的酸解离常规压片法的制片效果，试图找到最适合黄麻的中期分裂相清晰的染色体制备方法。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为圆果黄麻179品种，将少量种子用0.1%HgCl2溶液消毒10min，在清水中浸种过夜，放入底部垫有滤纸的培养皿中于28℃催芽。待根长至1.5cm左右时，取其距顶端3mm左右的根尖进行预处理。

1.2 试验方法

1.2.1 不同预处理条件下的去壁低渗涂片法

参考李懋学方法[7]，将取下的黄麻179的根尖分别置于0.002mol.L-1 8-羟基喹啉溶液和0.2%的秋水仙素溶液的玻瓶中，前者浸泡3.5小时，后者浸泡2小时进行预处理，温度都保持在10℃-15℃。分别去掉预处理液，用0.075mol.L-1 KCl低渗液浸没材料，25℃下处理30min进行前低渗。倒去KCl溶液，用蒸馏水充分洗净，加入混合酶（纤维素酶与果胶酶各占2.5%），26℃下酶解2小时。回收酶液，用蒸馏水分别慢洗3次，在25℃双蒸馏水中停留10min进行后低渗处理。将后低渗的材料用卡诺固定液在10-15℃下固定20小时以上。分别取3个固定后的根尖材料置于预先洗净、冷冻的载玻片上，滴1滴卡诺固定液，并用镊子敲碎涂抹，去掉大块组织残渣，在酒精灯火焰上掠过3次左右，使其干燥。将载玻片置于Giemsa染色液中25℃下染色4个小时以上，蒸馏水冲洗，空气干燥后即可油镜镜检，选择分散良好、清晰的中期染色体再进行显微拍照。

1.2.2 去壁低渗悬液法

参考陈瑞阳方法[8]，将根尖用0.002mol.L-1 8-羟基喹啉溶液浸泡3.5小时作预处理，温度保持在10℃-15℃。然后进行前低渗、酶解去壁、后低渗处理，方法同1.2.1。倒去后低渗的双蒸水，用镊子将材料挟碎、搅拌，形成细胞悬液。再向黄麻179根尖细胞悬液加入适量卡诺固定液，10-15℃下静置固定30min，吸取上层细胞悬液，去除大块组织沉淀。将上层细胞悬液静置25min，细胞沉淀后，轻轻地吸去上清液，留1mL左右细胞悬液为染色体标本滴片备用。取一张预先洗净并冷冻的清洁载玻片，滴2-3滴细胞悬液滴在玻片上，立即将玻片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上掠过3次左右，使其干燥。最后Giemsa染色、镜检过程的方法同1.2.1。

1.2.3 预先固定的去壁低渗涂片法

将根尖用0.002mol.L-1 8-羟基喹啉溶液浸泡3.5小时作预处理，温度保持在10℃-15℃。双蒸水洗净后用新鲜的卡诺固定液，在10-15℃下固定20小时以上。接下来的前低渗、酶解去壁、后低渗、涂片、Giemsa染色、镜检等步骤方法同1.2.1。

1.2.4 不同酸解时间下的酸解离常规压片法

参考王春台方法[9]，将根尖用0.002mol.L-1 8-羟基喹啉溶液浸泡3.5小时作预处理，温度保持在10℃-15℃。双蒸水洗净后用新鲜的卡诺固定液固定20小时以上，温度以10-15℃为宜。倒去固定液，用蒸馏水洗3次。将根尖分成三份，再放入预热的1 mol.L-1盐酸中，60℃水浴中分别解离6min、8.5min、11min，然后分别用双蒸水漂洗3次，每次5min。分别将根尖放于洁净、冰冷的载玻片上滴加改良的石碳酸品红染色，25℃染色2小时，盖上盖玻片，用镊子轻轻敲打盖玻片，然后用滤纸吸去多余染液，用铅笔的橡皮头敲打，使细胞分散。最后镜检、显微拍照。

2 结果与分析

2.1 不同预处理方法对染色体制片效果的影响

在1.2.1实验中，采用不同预处理方法，其他实验步骤相同的条件下，对制片效果进行比较（见图1），图1A为根尖用0.2%的秋水仙素溶液进行预处理下的中期分裂相，染色体比较小，有收缩，边缘模糊，缢痕不清晰，核型分析效果较差。图1B为根尖用0.002mol.L-18-羟基喹啉溶液进行预处理下的中期分裂图像，染色体较大，背景清晰，缢痕明显，分散度适当，可作为核型分析。故在后续试验中均用0.002mol.L-18-羟基喹啉溶液进行预处理。

2.2 去壁低渗法中涂片法与细胞悬液滴片法的制片效果

图2A和2B为都为细胞悬液滴片法处理下黄麻179染色体中期分裂图像，相对于涂片法得到的图1B，细胞悬液滴片法会使染色体分散度太大，可能造成染色体丢失。在挟碎细胞时可能会损毁染色体（如图2B），而且使细胞碎片过多，图像背景不清晰。比较可知，去壁低渗法中涂片比细胞悬液滴片的制片效果要好。

2.3 去壁低渗法中材料固定先后对制片效果的影响

图3A和3B都为用预先固定的去壁低渗涂片法制得的黄麻179染色体中期分裂图像，相对于采用后固定的去壁低渗涂片法制得的中期分裂图像图1B，图3A和图3B中的染色体分散程度太低，染色体粘在一起，核型分析效果相对较差。比较可知去壁低渗法中材料后固定比预先固定的制片效果要好。

2.4 不同酸解时间对制片效果的影响

图4A为酸解5min的黄麻179染色体中期分裂图像，染色体模糊，分散程度太低，染色过浅。图4B为酸解8.5min的黄麻179染色体中期分裂图像，染色体比较清晰，缢痕清晰，分散度适当，背景清晰，可用于核型分析。图4C酸解11min的黄麻179染色体中期分裂图像，染色体已发生形变，大小不均匀，染色深浅不一。比较可知。酸解时间为8.5min时染色体制片效果较好。

3 讨论

麻类染色体普遍较小，中期染色体通常在0.5-1.5 μm之间[10]，如此小的黄麻染色体要获得比较好的中期分裂图像，就必须做到染色体分散程度高，染色体不能收缩，背景要清晰。

图1 用秋水仙素溶液（图1A）和8-羟基喹啉溶液（图1B）作预处理的中期分裂图像Fig.1 Chromosomeinmetaphasestagepretreatedbycolchicinesolution（Fig.1A）and8-hydroxyquinolinesolution（Fig.1B）

图2 图2A、2B均为细胞悬液滴片法处理下黄麻179染色体中期分裂图像Fig.2 The jute 179 chromosome in metaphase stage treated bycell hypotonic suspension method

图3 图3A、3B均为预先固定的去壁低渗涂片法制的黄麻179染色体中期分裂图像Fig.3 Thejute179chromosomeinmetaphasestagetreatedbypre-fixedwalldegradationhypotonicsmearmethod

实验过程中发现使用秋水仙素预处理时，浓度和处理时间要控制得当，若秋水仙素浓度过低，就难以获得较多的中期分裂相；若秋水仙素的使用浓度过高或处理时间太长，可能会引起染色体收缩成粒状或短棒状，影响制片效果。而8-羟基喹啉最大的优点就是显示缢痕、随体清晰[11]，也不致引起染色体的粘连，本实验也验证了这一点。后固定的去壁低渗法因是活体原生质，半渗透性好，吸水速度快，染色体因低渗作用而分散到细胞质内，所以染色体分散程度比较高，容易获得比较好的染色体图象。而先固定的去壁低渗法细胞固定后使细胞质失去半渗透性，染色体难以随低渗作用分散到细胞质内，所以在低渗吸水的时间需要很长的才会使细胞软化膨胀，染色体分散的效果不是很好。去壁低渗中的涂片法比悬液法操作简单，且能更容易找到中期分裂相，背景也较清晰，而实验过程中悬液法需要的根尖材料比较多，挟碎过程中可能会损坏染色体。从本实验结果来看，8-羟基喹啉处理下的后固定去壁低渗涂片法，相对其他的去壁低渗法制得的图片效果更好，但实验过程中酶解时间的控制是关键，需不断摸索优化。

酸解离常规压片法比去壁低渗法操作上更简便，时间更短，关键是酸解时间的控制。若盐酸解离时间太短，染色不清晰，细胞质也染上深浅不同的颜色；若处理时间过长，染色体染色极淡或不染色。这可能与酸解不够，醛基暴露不充分有关，而呈现染色过浅。酸解过度，则使DNA完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，流离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而使染色浅或不均一[12]。本实验发现酸解8.5min时制得的黄麻179染色体中期分裂图像效果比较好。

通过比较这4种方法制得的中期图片，笔者认为酸解离常规压片法最适合制备黄麻染色体中期图片，此法制得的图片效果较好、分散度适当、缢痕清晰、形态良好、背景清楚，且此法操作比较简单，快捷。黄麻属于小染色体类，要获得形态良好、分散适当、着丝点清晰的染色体图进行核型分析，难度比较大，还需要不断优化制片技术，以求获得更完美的染色体中期分裂图像。

图4 酸解6min（图4A）、8.5min（图4B）、11min（图4C）的黄麻179染色体中期分裂图像Fig.4 The jute 179 chromosome in metaphase stage byacid dissolution 6 minutes，8.5 minutes and 11 minutes respectively

[1] 祁建民，李维民，吴为人.黄麻的起源与进化研究[J].作物学报，1997，23（6）：678-679.

[2] 熊和平.麻类作物育种学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2008.

[3] STANCECA.Cytology and cytogenetics as fundmental taxomomic resources for 20th and 21st centuries[J].Taxon ，2000，49：451-477.

[4] 洪德元.中国和日本产竹叶子（亚种）核型的一致性[J].植物分类学报，1986，24（4）：264-267.

[5]Banerjee，I.Chromosome number ofIndian crop plants.A.Chromosome numbers in jute[J].Indian Bot.Soc.11：82-85.1932a.

[6] 谢小芳，黄代青，吴为人.长果种黄麻单染色体未克隆DNA文库的构建[J].作物学报，2006，32（8）：1184-1187.

[7] 李懋学，张赞平.作物染色体及其研究技术[M].北京：中国农业出版社，1996.

[8] 陈瑞阳，宋文芹，李秀兰.植物染色体标本制备的去壁低渗法及其在细胞遗传学中的意义 [J].遗传学报，1982，9（2）：151-159.

[9] 王春台.图解现代遗传学实验[M].北京：化学工业出版社，2009.

[10] 朱凤绥，何广文，肖瑞芝，李树川，田自强，程尧楚.麻类作物染色体组型分析及Giemsa带型初步观察[J].中国麻作，1981，（3）：1-9.

[11] 朱徵.植物染色体及染色体技术[M].北京：科学出版社，1982.

[12] 卢笼斗，常重杰.遗传学实验技术[M].北京：科学出版社，2007.