HPLC法检测盐酸多奈哌齐片中有关物质含量

曹嘉，冉兰，陈霞

（1.四川大学华西药学院，成都市 610041；2.四川抗菌素工业研究所，成都市 610052）

盐酸多奈哌齐（Donepezil hydrochloride）的化学名为1-苄基-4-[（5，6-二甲氧基-1-茚满酮）-2-基）甲基]哌啶盐酸盐，是治疗阿尔茨海默病的第2代胆碱酯酶（AchE）抑制剂，能够增加大脑乙酰胆碱含量，是治疗早、中期老年性痴呆的有效药物[1，2]。目前各国药典中尚未收载该品种的有关物质的检查方法，国内文献亦尚未见报道。为有效控制产品质量，本文参照盐酸多奈哌齐原料的有关物质检查方法[3]，采用高效液相色谱（HPLC）法中常用的不加校正因子的主成分自身对照法对盐酸多奈哌齐片中有关物质进行了检测，以对本品进行更有效的内在质量控制。

1 仪器与试药

LC-2010C HPLC仪，包括CLASS-VP色谱工作站（日本岛津公司）。

盐酸多奈哌齐原料（重庆桑田药业有限公司，批号：M20071201，含量：99.8%）；盐酸多奈哌齐标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100650-200301，含量：99.9%）；盐酸多奈哌齐片（四川大学华西药学院，批号：081011、081012、081013，规格：每片5 mg）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.01 mol·L－1磷酸氢二钾溶液（含3%三乙胺，用磷酸调pH至4.3）-甲醇（60∶40）；检测波长：271 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min－1；进样量：20 μL；以盐酸多奈哌齐峰计算，色谱柱的理论塔板数为6600，各峰与其相邻峰的分离度均符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备。取本品10片，研细，精密称取适量（约相当于盐酸多奈哌齐10 mg），置于10 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照溶液的制备。精密量取供试品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 标准品溶液的制备。精密称取盐酸多奈哌齐标准品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度；精密量取该溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备。按比例量称取不含盐酸多奈哌齐的空白辅料适量，按“2.2.1”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 检测波长的选择

精密称取盐酸多奈哌齐标准品适量，用流动相溶解制成每1 mL中含盐酸多奈哌齐约20µg的溶液；按比例量称取不含盐酸多奈哌齐的空白辅料适量，同法制得空白辅料溶液。分别于200～400 nm波长内进行紫外扫描，结果，盐酸多奈哌齐分别在230、271、315 nm波长处有最大吸收，而空白辅料在271、315 nm波长处无吸收。通过HPLC试验进一步可知，采用271 nm波长进行有关物质检测时能检测到较多杂质峰，在315 nm波长进行测定时杂质峰数目减少。故采用271 nm作为本品有关物质的检测波长。

2.4 专属性试验

2.4.1 辅料干扰考察。照“2.1”项下的色谱条件，精密量取阴性样品溶液、标准品溶液、供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱，见图1。

图1 高效液相色谱图A.阴性样品；B.标准品；C.供试品；1.盐酸多奈哌齐Fig 1 HPLC chromatogramA.negative sample；B.standard sample；C.test sample；1.donepezil hydrochloride

由图1可知，原料杂质峰、辅料峰、主成分峰均能完全分离，辅料无干扰。

2.4.2 降解物干扰考察。精密量取供试品溶液5 mL 3份，分别进行以下试验：加1 mol·L－1盐酸溶液10 mL，在80℃水浴中加热1 h；加1 mol·L－1氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，常温下放置5 min；加30%过氧化氢溶液1 mL，在60℃水浴中加热10 min。另取本品10片2份，精密称定，分别进行以下试验：置于白炽光（4500照度）下照射7 d；置于130℃烘箱中加热1 h。将上述破坏后样品分别制成每1 mL中约含1 mg盐酸多奈哌齐的降解溶液，照“2.1”项下的色谱条件，精密量取上述降解溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱。结果破坏试验产生的降解产物峰均能与主成分峰完全分离。

2.5 检测限考察

取供试品溶液用流动相稀释成系列浓度，进样，当信噪比为3时进样量即为最低检测限。测得最低检测限为0.05 ng（S/N＝3）。

2.6 耐用性试验

在“2.1”项色谱条件的基础上，对流动相的组成、柱温、流速、同类型不同品牌的色谱柱等进行耐用性考察，其中流动相比例分别为磷酸氢二钾溶液-甲醇（60∶40）、磷酸氢二钾溶液-甲醇（59∶41）、磷酸氢二钾溶液-甲醇（61∶39）；柱温分别为30 ℃、35 ℃、40 ℃；流速分别为0.9、1.0、1.1 mL·min－1；pH值分别为4.30、4.32、4.34；色谱柱分别为AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5µm）、资生堂 ODS柱（250 mm×4.6 mm，5µm）。结果，当系统条件发生微小变化时，测定结果不受影响，各色谱峰之间均能达到有效的分离。说明本法的耐用性良好，符合测定要求。

2.7 有关物质测定

照“2.1”项下的色谱条件，精密量取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液的色谱中如显杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。3批样品有关物质测定结果见表1。

表1 3批样品有关物质测定结果Tab 1 Determination of related substance in 3 batches of samples

3 讨论

在进行色谱条件筛选时，曾使用不同品牌的150 mm C18色谱柱进行试验，经多次调整均不能到达有效分离的要求，最终确定使用250 mm C18柱。

在进行色谱条件优化时，发现主峰拖尾较为严重，后来加入适量三乙胺，可以改善主峰峰形。

破坏试验结果表明，本品对光、强酸、热等因素较稳定，而对碱、氧化等因素较敏感。

综上所述，本方法专属性强、灵敏度高，可用于该制剂中有关物质的检测。

[1]Ihara M，Ohxishi A，Tomono Y，et al.Pharmacokinetics of E2020，a new compound for Alzheimer’s disease，in healthy male volunteers[J].Int J Clin Pharm Ther Toxi，1993，31（5）：223.

[2]OhnishiA，MiharaM，Kamakura H，et al.Comparison of the pharmacokinetics of E2020，a new compound for Alzheimer’s disease，in healthy young and elderly subjects[J].J Clin Pharmacol，1993，33（11）：1086.

[3]国家食品药品监督管理局国家药品标准[S].WS1-（X-140）-2004Z.