13C3-三聚氰酸、15N3-三聚氰胺的合成工艺研究

张丽雅,杨维成,罗 勇

(上海化工研究院,上海 200062)

近年来,不法商贩以提高蛋白质检测数值为目的,向饲料和奶制品中非法添加三聚氰胺、三聚氰酸等含氮量高的化工原料,造成了严重的食品安全问题,并引发了世界范围内对中国造食品安全的信任危机。因此,针对奶制品和其他食品检测三聚氰胺和三聚氰酸含量是当前食品安全的重要任务之一。

三聚氰胺、三聚氰酸的实验室检测方法主要有以下三类:①反相液相色谱法,检测限通常达2μg/g[1];②气相色谱-质谱联用法,检测食品中三聚氰胺最低报告水平是10 ng/g[2];③液相色谱-质谱联用法,检测灵敏度通常达到 ng/g水平。在采用同位素稀释质谱法(Isotope Dilution Mass Spectrometry,IDMS)后,三聚氰胺定量限达到0.1 ng/g[3]。

IDMS是采用与被测物质具有相同分子结构的稳定性同位素(15N、13C、2H等)标记的化合物作为内标物质,用高分辨液相色谱-质谱联用仪(LC/MS)进行检测,通过质谱仪测量相应质量数的离子的m/z并与标准的m/z进行比较达到准确定量的目的。

利用同位素稀释质谱法检测食品中的三聚氰胺、三聚氰酸,同位素内标试剂三聚氰胺、三聚氰酸是不可或缺的工具。目前,尚无文献公开报道同位素标记三聚氰胺、三聚氰酸的合成方法,市售的同位素标记三聚氰胺、三聚氰酸均被跨国公司垄断。开展同位素标记三聚氰胺、三聚氰酸的合成研究工作有利于打破国外垄断,完善我国食品安全检测技术体系,满足我国食品安全发展的需求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Nicolet 6700红外吸收光谱仪:美国尼高力公司产品;LC-20AT高效液相色谱:日本岛津公司产品;240C元素分析仪:美国珀金埃尔默公司产品;TSQ Quantum Access液质联用仪:美国热电公司产品;MAT-271气体同位素质谱计:美国菲尼根公司产品;不锈钢反应釜:上海化工研究院设计制造,耐压20 kg,带有温控系统。

1.2 主要材料与试剂

15N-氯化铵、13C-尿素:分析纯,上海化工研究院产品;二氧六环、氨水、环丁砜、二苯醚、DMF、硝基苯:分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司产品;乙腈:色谱纯,上海凌峰化学试剂有限公司产品;丙酮:分析纯,上海试剂一厂产品;三聚氰氯:分析纯,百灵威公司产品;醋酸铵、庚烷磺酸钠:色谱纯,上海安谱公司产品;柠檬酸:分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司产品。

1.3 三聚氰酸的合成[4-7]及分析

三聚氰酸的合成路线示于图 1。将 5 g(0.083 mol)尿素、8 mL环丁砜加入三口烧瓶中,搅拌加热至120℃,开启真空泵将体系压力降至0.013 MPa,继续升温至回流,保持1～2 h。冷却后,对反应液进行抽滤、水洗,得到三聚氰酸白色晶体。

图1 三聚氰酸的合成路线

分别采用美国Themo Fisher Scientific公司的 Accela高效液相色谱仪和美国Themo Fisher Scientific公司的TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪对所得三聚氰酸进行定性和定量分析。

色谱分析:三聚氰酸晶体用乙腈溶解,过0.45μm滤膜后进行色谱分析。色谱条件:采用Hypersil Gold柱(150 mm ×4.6 mm,5μm)作为固定相;V(乙腈)∶V(甲酸水溶液)=95∶5为流动相,等梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温为室温,检测波长214 nm。

质谱分析:采用电喷雾(ESI)离子源,负离子模式,喷雾电压 3 000 V、鞘气 30 arb、辅助气5 arb、毛细管温度 350 ℃、Q1分辨率 0.7 u、扫描范围m/z=30～150。

1.4 三聚氰胺的合成[8-13]及分析

三聚氰胺的合成路线示于图2。将7.38 g(0.04 mol)三聚氰氯、40 mL二氧六环加入到反应釜中,于0～5℃下加入含0.24 mol NH 3的氨水,密封反应器,升温至140℃,反应4 h。冷却后,抽滤、水洗、重结晶得到三聚氰胺白色晶体。

分别采用日本岛津公司的LC-20AT高效液相色谱仪和美国Themo Fisher Scientific公司的TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪对所得三聚氰酸进行定性和定量分析。

色谱分析:用50%乙腈水溶液溶解三聚氰胺,过0.45μm滤膜后进行质谱分析。色谱条件:采用 Venusil ASB C18柱(46 mm×150 mm)作为固定相;V(柠檬酸庚烷磺酸钠溶液)∶V(乙腈)=92∶8作为流动相;检测波长240 nm;流速为1.0 mL/min。

质谱分析:采用电喷雾(ESI)离子源。三聚氰酸采用负离子模式,喷雾电压3 000 V、鞘气30 arb、辅助气5 arb、毛细管温度350 ℃、Q1分辨率0.7 u、扫描范围m/z=30～150。三聚氰胺采用正离子模式,喷雾电压 4 500 V、鞘气38 arb、辅助气8 arb、毛细管温度350 ℃、Q1分辨率0.7 u、扫描范围m/z=30～150。

图2 三聚氰胺的合成路线

2 结果与讨论

2.1 13C3-三聚氰酸的合成结果

合成三聚氰酸化学反应式如下:

由以上化学反应可知,尿素经反应(1)发生裂解反应,此过程较慢;经反应(3)聚合生成三聚氰酸是自发反应,反应(1)生成的氨气若不能及时被移走,反应(4)就会大量发生。反应(1)和反应(2)是平行反应,在温度低时反应(2)更容易发生,但是当温度升高时,缩二脲会发生分解。

2.1.1 溶剂对三聚氰酸收率的影响

由合成三聚氰酸反应过程可知,升高温度有利于生成的缩二脲分解,促进缩合反应进行。选择合适的高沸点溶剂,适当提高反应温度有利于反应进行,但常压下回流,反应温度过高,溶剂在其常压沸点附近会分解,发生不期望的副反应。选用高沸点溶剂环丁砜(285℃)、二苯醚(255 ℃)、DMF(155 ℃)、硝基苯(210 ℃)等作为反应介质进行温度条件实验,同时调整反应体系的压力控制回流温度,结果列于表1。由表1可知,采用环丁砜作为反应介质时可获得良好收率,二苯醚和硝基苯次之,DMF最低;适当保持系统负压(0.013 MPa),降低溶剂的回流温度,可以得到更好的收率。表1显示,以环丁砜为溶剂,保持系统负压0.013 MPa,反应的回流温度控制为205℃,三聚氰酸的收率最高,达83%。

2.1.2 压力对三聚氰酸收率的影响

以环丁砜作为反应介质,其与尿素的比例不变,只改变反应体系压力,其他反应条件按1.3节进行,结果列于表2。分析表2可知,通过保持系统适度负压,将反应产生的氨气及时除去,有利于提高目标产物三聚氰酸的收率。在一定范围内,三聚氰酸的产率随体系压力增大而增大,当反应压力为0.013 MPa与0.019 MPa时,反应收率达到最大。这主要是由于环丁砜的回流温度随体系压力增大而升高,温度升高有助于减少副产物缩二脲的生成,从而提高三聚氰酸收率。但是随着系统压力进一步升高到0.024 MPa时,产品呈现黄色,这可能是回流温度过高,加速了环丁砜分解所致。因此,优选反应压力为0.013～0.019 MPa。

表1 溶剂对三聚氰酸合成收率的影响

表2 压力对三聚氰酸收率的影响

2.1.3 反应时间对三聚氰酸收率的影响

1.3 节中,其他条件不变,仅改变反应时间,实验结果列于表3。由表3可知,随着反应时间延长,产品收率上升,并在1.5 h时达到较高收率;随着反应时间进一步延长,产品收率趋于恒定。表明,反应进行1.5 h即达到平衡,因此三聚氰酸的合成时间控制在1.5 h为宜。

2.1.413C3-三聚氰酸的合成与表征

在上述合成工艺优化的基础上,确定最佳工艺条件为:尿素0.083 mol、环丁砜8 mL、反应压力0.013 MPa、反应温度 205℃、反应时间1.5 h。以13C-尿素(13C丰度为98.50%)为标记前体,进行三聚氰酸合成的丰度实验。结果显示,产品收率83.2%。13C3-三聚氰酸的色谱保留时间为3.77 min,与标样的保留时间一致。采用外标法对其进行定量,纯度为99.2%,13C同位素丰度为 98.10%,同位素丰度下降了0.40%。

表3 反应时间对合成三聚氰酸收率的影响

产物表征:用元素分析仪对产物进行元素分析(%),C3H3N3O3实测值(计算值):C 27.82(27.91);H 2.53(2.34);N 32.22(32.56);IR(υ/cm-1,KBr):3 113.8 、3 028(νO-H),1 777.5、1 751.7、1 720(νC=N,三嗪环中碳氮双键),1 464.3、1 398.5(νC-N,三嗪环中碳氮单键),775.2、754.1为三嗪环特征峰;MS:m/z=128为三聚氰酸的[M-H]-峰,m/z=85为[C2H 2N2O2]-峰,m/z=42为[N≡C-O]-峰。合成的高丰度同位素标记13C3-三聚氰酸,由于三嗪上碳原子为同位素13C标记,其质量数增加3个单位,[M-H]-峰为m/z=131,主要碎片离子相应变为m/z=87、43。

2.2 15N3-三聚氰胺的合成

2.2.1 反应介质对三聚氰胺收率的影响

三聚氰氯具有三嗪化合物的反应特性:3个Cl原子可分步取代,使用极性介质有利于反应进行[9-10,13]。考虑到主要反应物三聚氰氯和氨水的溶解性,分别选用丙酮、二氧六环、水、甲苯作为反应介质,反应按1.4节进行,其他条件不变,只改变反应介质。常压下各介质在相应的回流温度下进行反应,实验结果列于表4。由表4可知,当反应介质为二氧六环时,产物以三聚氰胺为主。因此,选择以二氧六环作为反应介质。

2.2.2 反应温度对三聚氰胺收率的影响

由于氨水的易挥发性,实验采用不锈钢反应釜。反应按1.4节进行,以二氧六环为溶剂,其他条件不变,只改变反应温度,同时保持体系密闭,实验结果列于表5。由表5可知,适度升高反应温度有利于提高三聚氰胺产率,在130～140℃范围内即可获得理想的收率。随着反应温度进一步升高,产物收率略有下降,因此,反应温度以130～140℃为宜,此时三聚氰胺的收率＞96%。

表4 反应介质对三聚氰胺收率的影响

表5 反应温度对三聚氰胺收率的影响

2.2.3 溶剂用量对三聚氰胺收率的影响

1.4 节反应中,改变溶剂用量,其他条件不变,实验结果列于表6。三聚氰氯的分步取代反应需要适宜的反应环境。溶剂量过少,三聚氰氯溶解不够充分;而溶剂量过多又会造成三聚氰氯浓度降低,影响反应的收率。由表6可以看出,在本实验的配比下,溶剂二氧六环用量为40 mL,三聚氰胺收率最高,可达98%。

表6 溶剂用量对合成三聚氰胺的影响

2.2.415N3-三聚氰胺的合成与表征

在上述合成工艺优化的基础上,确定最佳工艺条件为三聚氰氯0.04 mol、二氧六环40 mL、NH 3 0.024 mol、反应温度 130～140 ℃、反应时间4 h。以15N-氯化铵(99.55%15N)为标记前体,进行三聚氰胺合成的丰度实验,产品收率97.2%。15N3-三聚氰胺的色谱保留时间为16.98 min,与标样的保留时间一致。采用外标法对其进行定量,纯度为99.7%,MS检测15N同位素丰度为99.49%,产物的同位素丰度下降＜0.1%。此结果表明,所合成的15N3-三聚氰胺可以作为同位素内标。

产物表征:用元素分析仪对产物进行元素分析(%),C3N 6H 6实测值(计算值):C 28.44(28.56);N 66.72(66.64);H 4.84(4.80);IR(υ/cm-1,KBr):3 468.6 、3419.3(νN-H),1 685.1、1 649.3(νC=N,三嗪环中碳氮双键);LC-MS检测:m/z=127为[M+H]+峰,m/z=110为[M-NH 2]+峰,m/z=85为[C2 N4H 5]+峰,应是母离子[C3N6 H7]+脱掉NCNH 2后形成的子离子,m/z=68为[C2N3H2]+峰,为 C2N4H5+脱去NH 3所得。在高丰度同位素标记15N3-三聚氰胺的质谱图上,m/z=130为[M+H]+峰,由于3个氨基上N元素均为15N,其质量数增加3个单位,m/z=112为[C314N 315N2 H4]+峰,m/z=87为[C215N 214N 2H 5]+峰。

3 结 论

(1)设计并完成了适合稳定同位素标记用内标物13C3-三聚氰酸、15N3-三聚氰胺的合成工艺。以15N-氯化铵为原料,经分步取代合成得到15N3-三聚氰胺;以13C-尿素为原料,采用高沸点溶剂,经液相合成方法制备得到13C3-三聚氰酸。

(2)考察了合成条件对产品收率的影响,获得了较优的合成工艺。

(3)产品经HPLC、MS检测,化学纯度大于99%,同位素丰度高于98%,可作为同位素内标应用。

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