HPV基因分型检测与非典型鳞状细胞的相关性研究

王旭洲 余英豪 黄惠娟 宋屿娜 谢飞来 吴 敏

人乳头瘤病毒(human papilloma viruses，HPV)是1种可引起人类皮肤和黏膜组织良性及恶性肿瘤的病毒，在人类的感染非常普遍。迄今为止，已发现的HPV有100多个型别，各型别与体内特定感染部位和病变有关，其中40多个型别与人类生殖道疾病有关［1］。进一步可分成与生殖道疣相关的低危型与宫颈癌相关的高危型。应用HPV分型技术对难以确定的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined signification，Asc-us)和宫颈脱落细胞轻度病变作进一步的判断，是1种有效的再分类方法［2］。本文采用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术(flowthrough hybridization and gene chip)和表面等离子谐振技术(简称SPR)，对50例Asc-us病例标本进行检测，探讨对Asc-us病例的分流监测和宫颈癌初筛的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

50例我院门诊宫颈薄层液基细胞学(LCT)检查结果为Asc-us的病例，年龄21～82岁，平均36.75岁，均无急性生殖道炎、子宫颈锥切和子宫切除史。

1.2 研究方法

1.2.1 LCT检测 LCT采用美国 PREPSTAIN公司RSP-5051型液基细胞仪(包括细胞采集系统及检测系统)。细胞采集方法:将取样毛刷插入宫颈内，按同一方向转动毛刷5周;取出后折断毛刷颈，将毛刷头放入液基瓶中送检;置液基瓶于震荡器上震荡，将毛刷头上的细胞洗脱。检测方法:①将标本有秩序地放入取材框，黏贴标签，放入注射器，加入4 ml密度液，逐个振荡20 s;②打开取材机，将标本框放入取材机;③将取完材的标本按顺序放入对号的离心盒内并进行离心;离心后取出标本进行抽吸黏液:打开抽吸泵，将标本逐个抽吸，每管均一致，再将标本放入离心机进行二次离心;④倒去标本上清液，留下“沉淀物”，逐个振荡20 s，将标本(离心盒应对号入座)放入主机，开机等待10 min并染色;⑤系统自动进入染色程序。染色后的片子先放入异丙醇-无水酒精(1∶1)后直接移入二甲苯中，5 min后封片、贴标签，显微镜下观察。诊断参考2001年修订的TBS系统标准［3］。

1.2.2 HPV分型检测 HPV基因扩增分型检测试剂盒，核酸分子快速导流杂交基因芯片和SPR平台均由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。待测标本为上述LCT确定为Asc-us病例的子宫颈脱落细胞样本，用专用细胞保存液保存。主要步骤如下:取1 ml细胞悬液加入离心管内，12 000 rpm离心10 min，弃去上清，500 μl细胞清洗液冲洗细胞，12 000 rpm离心10 min，重复2次，加入200μl的 DNA快速裂解提取液，56℃15 min，95℃15 min 后，12 000 rpm 离心 3 min，吸取上清液10μl加入到PCR反应体系中按照扩增条件进行扩增(每次均同时扩增一阳性对照)，取阳性扩增产物20μl和杂交缓冲液60μl加入每个扩增反应管内，置水浴锅或PCR仪中95℃加热5 min后，点样杂交。杂交过程在核酸分子快速导流杂交基因芯片仪W2600型SPR平台上进行。HPV分型芯片涵盖24型(高危型:16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型;低危型:6、11、40、42、43、44、54 和70 型)。

1.2.3 阴道镜检查及病理活检 所有Asc-us病例均由本院妇产科医生进行阴道镜检查，对可疑病灶进行阴道镜下定位活检。镜下未发现明显异常或图像不满意者，则行宫颈多点活检。所有活检标本以各项诊断中最高级别作为组织病理学最后诊断依据。根据子宫颈鳞状上皮细胞异常增生程度分为无上皮内瘤变或恶性变(negative for intraepithelial lesion or ma1ignancy，NILM)，子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。凡≥CINⅡ级定义为子宫颈高度病变。

1.3 统计学处理

以组织病理学检查结果为标准，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV分型检测结果

50例中HPV阳性23例(46.0%)，其高危型HPV阳性者17例(同时合并低危型HPV阳性者4例)，单纯低危型HPV阳性者6例(合并感染4例)，HPV阴性者27例。

2.2 组织病理学检查结果

50例中无NILM 病例，CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级分别为15、26和9例，其中子宫颈高度病变35例(70.0%)。在子宫颈高度病变者中高危型HPV阳性病例15例(42.9%)，单纯低危型 HPV 阳性4例(11.4%)，合并感染4例，HPV分型阴性16例(45.7%)。组织学检查结果与HPV基因分型的对应关系见表1。

表1 Asc-us病例HPV基因分型与组织学检查结果的对应关系(例)

2.3 HPV分型与子宫颈高度病变的关系

高危型HPV阳性病例中子宫颈高度病变率为88.2%(15/17)，其中1例同时有5个型别高危型HPV 感染(31，56，59，66，81);单纯低危型 HPV 阳性病例中子宫颈高度病变率为66.6%(4/6)，HPV分型阴性病例中子宫颈高度病变率为59.3%(16/27)，经过统计学处理χ2检验，三者子宫颈高度病变率差异有统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

子宫颈鳞状上皮细胞与柱状上皮细胞的连接处是HPV的易感部位［4］，由于HPV病毒尚未在活细胞里分离成功，因此难以用细胞培养方法培养HPV。人感染HPV后，机体产生的抗体在体内可长期存在，血清学方法检查抗体不能确定是近期感染或既往感染。因此，发展新的诊断HPV感染方法主要通过分子生物学检测来实现。目前用于HPV分型检测的方法主要有原位杂交技术、型特异性PCR和通用引物PCR技术、实时荧光定量PCR技术和杂交捕获技术等［5］。

表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术是研究生物分子相互作用的重要工具之一，该技术使生物分子之间相互作用的实时检测成为可能，并且灵敏度高、是1种无标记和实时动态的快速检测方法。通过分析传感图谱及分子相互作用的响应值获取分子相互作用的模式和动力学常数等信息，并且能够对获得的信息进行定性和定量。SPR技术已广泛应用于生物、化学、免疫学研究及新药开发等领域［6，7］。但应用该技术进行HPV分型检测，文献中尚未见报道。本研究采用北京金菩嘉医疗科技有限公司提供的HPV核酸扩增分型检测试剂盒和W2600型SPR技术平台检测24种HPV亚型，可同时检测出多型感染，并可判断是持续感染或再次感染，该试剂盒性能稳定，重复性好。

自20世纪50年代开始采用传统巴氏涂片大规模实施子宫颈癌筛查以来，宫颈癌的发病率和死亡率明显下降。近年发展起来的液基薄片技术在制片技术上取得的进步，减少了涂片的不满意率，降低了漏诊率［8］。2001年修订后TBS诊断系统以明确、恰当的方式表达细胞学判读结果。促进了子宫颈/阴道细胞病理学诊断报告系统的统一，达到细胞病理与临床的有效交流。本研究即采用LCT进行子宫颈细胞学检查，并采用TBS系统来描述上皮细胞异常的分类，顺应了国际细胞学诊断规范化潮流或趋势。

本文选用病例LCT结果均为Asc-us。Asc-us是LCT诊断中介于正常鳞状细胞与异常细胞之间的一组细胞，其诊断标准为细胞核增大，是正常中层鳞状细胞核的2.5倍左右，核浆比例轻度增加。染色质轻微增多、分布不规则或核的形状不规则，有致密橘红色胞质的角化不良细胞常见。Asc-us既可以是良性反应性改变，也可能有潜在的癌前病变甚至子宫颈癌［9］。正因为Asc-us这种双向意义，我们选择其为研究对象，以期给这类病例的后续诊治提供帮助。目前在世界范围内已经确认感染高危型HPV是引起子宫颈癌及其癌前病变的必要因素，99.8%的子宫颈癌病例存在高危型HPV感染［10］。本研究结果显示，在50例Asc-us病例中高危型HPV的阳性率为34%(17/50);35例子宫颈高度病变高危型HPV的阳性率高达42.85%(15/35)，明显高于阴性单纯低危型HPV感染者，差异有统计学意义，与文献报道的相近。提示对于液基细胞学诊断为Asc-us的病例，应进行HPV分型检测，如提示高危型HPV阳性应立即进行阴道镜检查和活检，将有助于提高子宫颈高度病变的检出率。如无高危型HPV感染者可进行细胞学随访，减少不必要的阴道镜检查，减轻病例负担，节约医疗资源。

总之，HPV基因分型检测对子宫颈细胞学结果为Asc-us的病例能有效地进行分流监测，降低对子宫颈高度病变的漏诊率，提高筛查效力。

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