VEGF－C和VEGFR－3在鼻咽癌组织中的表达及其意义

骆梅青 李锡清

鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，早期即可发生淋巴道转移。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF－C)和血管内皮生长因子受体 3(vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR－3)［1］是与淋巴管生成及肿瘤淋巴道转移有关的因子。本实验通过对61例鼻咽癌的 VEGF－C和VEGFR－3进行免疫组织化学染色，观察两者在人鼻咽癌组织中的表达及其在淋巴道转移中的作用，以探讨鼻咽癌的淋巴道转移机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

所有组织标本均取自我院病理科2003年6月至2006年6月鼻咽镜下活检的鼻咽癌标本61例。所有标本活检后均经生理盐水冲洗，多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚连续切片。所有标本结果均经过常规病理检查确诊。

1.2 实验试剂

兔抗人VEGF－C多克隆抗体、兔抗人VEGFR－3多克隆抗体和兔抗人D2－40单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司，PV－9000二步法免疫组织化学试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3 组织化学染色方法

免疫组织化学染色方法均参照 PV－9000二步法试剂盒的说明书进行，4μm连续切片、脱蜡入水，3%甲醇过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，滴加鼠抗人单克隆抗体 D2－40及兔抗人 VEGF－C 及 VEGFR－3多克隆抗体，4℃冰箱孵育盒内过夜。滴加聚合物辅助剂，37℃温箱孵育30 min，滴加辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，37℃温箱孵育40 min，各步骤间均以PBS冲洗3次。DAB显色，蒸馏水及时终止。苏木精复染，脱水，中性树胶封片，光镜下观察。每次实验均以PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判定

免疫组化结果判定:VEGF－C、VEGFR－3阳性反应均为棕黄色颗粒，定位于细胞质和细胞膜。按细胞阳性着色程度，分弱阳性(+)为1分，中等阳性(++)为2分，强阳性(+++)为3分;依据阳性细胞数量分为弱阳性(+，阳性细胞数＜25%)为1分，中等阳性(++，指阳性细胞数在25% ～49%)为2分，强阳性(+++，指阳性细胞数在50%以上)为3分。计算方法为两者相乘，＜3分为阴性，3～6分为阳性，＞6分为强阳性。HPF至少随机观察5～10个，取其平均值。微淋巴管计数方法参照 Weidner［2］计数标准，在低倍镜下，选取肿瘤淋巴管最丰富的区域，然后在200倍视野范围计算3个视野的微淋巴管的数目，取其平均值(均数±标准差)作为LVD。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行统计学处理。统计方法采用χ2检验和Spearman相关分析。

2 结果

2.1 VEGF－C、VEGFR－3 免疫组化染色结果

VEGF－C主要表达于癌细胞的胞质，在肿瘤组织的间质中可见少量表达，另外在癌组织的血管和淋巴管内皮内也可见VEGF－C的阳性表达。

VEGFR－3主要表达于由单层内皮细胞构成、管壁较薄、外周无周细胞、无平滑肌的脉管，管腔内无红细胞，有的管腔内可见絮状物。少数阳性表达的脉管管壁较厚，可见肌层。另外在正常黏膜的间质内也可见少量表达。VEGFR－3标记的微淋巴管主要存在于鼻咽癌癌周间质和边缘组织中，而肿瘤内部一般较少微淋巴管，鼻咽癌组LVD明显高于鼻咽正常组。

2.2 鼻咽癌组织中的LVD

癌组织周边区淋巴管较为密集，而在肿瘤内部，淋巴管主要分布于黏膜下层内，淋巴管较为稀疏。61例鼻咽癌组织LVD均值为(8.12+2.44)，肿瘤内部LVD均值为(6.32+1.62)，肿瘤边缘区 LVD(10.40+3.06)明显高于肿瘤内部的 LVD，P ＜0.05。

2.3 VEGF－C、VEGFR－3 表达与 LVD 的关系

VEGF－C、VEGFR－3 的表达情况与 LVD 的表达存在相关性，VEGF－C或 VEGFR－3阳性，则 LVD的值较大，且经统计有显著性差异，见表1。

表1 VEGF－C、VEGFR－3表达和LVD的关系±s)

表1 VEGF－C、VEGFR－3表达和LVD的关系±s)

因素 例数 LVD P值VEGF－C+42 10.45+4.99－19 7.01+2.99 P ＜0.05 VEGFR－3+39 11.69+4.58－22 6.68+2.53 P＜0.05

2.4 VEGF－C表达与临床病理参数的关系

VEGF－C的表达率与淋巴结转移有关，而与年龄、性别、T分期无关，见表2。

表2 VEGF－C表达与鼻咽癌临床病理参数的关系

3 讨论

3.1 鼻咽癌组织中VEGF－C和VEGFR－3的表达

血管内皮生长因子(VEGF)家族在最近几年的肿瘤血管和淋巴管研究中日益受到重视。其中 VEGF－C被认为是与癌的淋巴道转移有关的因子。VEGF－C的受体包括 VEGFR－2和 VEGFR－3。此前的研究表明，VEGF－C通过与VEGFR－2结合促进血管的生成，通过与 VEGFR－3 的结合促进淋巴管的生成［3～5］。VEGF－C在人体的多种组织中都有表达。李慧文等［6］对VEGFC和其受体VEGFR－3在舌癌组织中的表达以及与淋巴结的转移的关系方面进行了研究，结果证明VEGF－C在舌癌组织中的表达明显增高，与癌的淋巴道转移呈正相关，并且 VEGFR－3和VEGF－C的表达显著相关。杨艳等［7］报道VEGF、VEGF－C 表达与喉鳞癌淋巴结转移有关，而与患者年龄、性别、病变部位、T分期、病理分级无关，但对于VEGFR－3的表达未做研究。本实验对61例鼻咽癌组织进行了免疫组化染色，结果显示VEGF－C在鼻咽癌周边组织中的表达明显高于肿瘤组织内。VEGFR－3的免疫组化染色结果显示，VEGFR－3广泛表达于多种组织，但主要表达于淋巴管。国内相关研究的报道，证实VEGFR－3在口腔头颈肿瘤有表达，且这种表达与肿瘤的淋巴道转移以及预后有关［8］。本实验的研究显示，随着癌的发生以及癌的进展，VEGF－C和VEGFR－3的表达均逐渐增高，它们有可能共同对癌的侵袭和转移起到了促进作用。

3.2 鼻咽癌组织中的LVD

自从Folkman在1970年首次提出肿瘤生长的血管依赖性假说以来，癌的血道转移一直是肿瘤研究的热点问题［9］，而在最近几年癌的淋巴道转移问题越来越受到人们的重视，但关于淋巴道转移的机制目前仍不清楚，特别是关于癌组织中淋巴管的数量、密度是否增加，是否存在淋巴管的新生等问题仍存在较大争议。

本实验通过对61例鼻咽癌的研究发现，在鼻咽癌周边组织中LVD明显高于肿瘤组织内，并且淋巴管密度的增加与VEGF－C的增加显著相关。分析VEGF－C和LVD与鼻咽癌病理参数之间的联系也发现，LVD与淋巴结转移相关，VEGF－C的表达与癌组织中的LVD显著相关，但VEGF－C的表达以及LVD均与患者的年龄、性别、T分期无关。这说明在癌组织中VEGF－C的增高是促进LVD增高的重要条件之一，而LVD的增高无疑将有利于癌的侵袭和转移。VEGF－C的这种作用可能是通过其受体 VEGFR－3来实现的，癌组织中VEGFR－3的表达也增高，这使得 VEGF－C的作用得到了更加充分的发挥。由癌细胞产生大量的VEGF－C与肿瘤周围间质内或存在于原有淋巴管内皮细胞上的VEGFR－3结合，诱导 VEGFR－3酪氨酸激酶磷酸化，进而促进了内皮细胞的增殖和迁移，使新的淋巴管生成以及原有淋巴管的分支和出芽，造成了淋巴管数量和密度的增加，使得癌细胞有更多的途径沿这些淋巴管向外播散和转移，这可能是癌细胞沿淋巴道转移的机制之一。

通过本实验的研究，我们认为癌组织中的淋巴管将有可能作为临床进行肿瘤治疗的靶点，这将可能为肿瘤的抗转移治疗提供新的方向。

［1］ Kukk E，Lymboussaki A，Taira S，et al.VEGF－C receptor binding and pattern of expression with VEGFR－3 suggests a role in lymphatic vascular development〔J〕.Development，2006，122(12):3829.

［2］ Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early－stage breast carcinoma〔J〕.JNatl Cancer Inst，1992，84(24):1875.

［3］ 张贺龙，王文亮.肿瘤淋巴管形成与肿瘤转移关系的研究进展〔J〕.临床与实验病理学杂志，2002，18(4):419.

［4］ He Y，Kozaki K，Karpanen T，et al.Suppression of tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis by blocking vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling〔J〕.J Natl Cancer Inst，2006，94(11):819.

［5］ Taniguchi K，Kohno R，Ayada T，et al.Spreads are essential for embryonic lymphangiogenesis by regulating vascular endothelial growth factor receptor 3 signaling〔J〕.Mol Cell Biol，2007，27(12):4541.

［6］ 李慧文，张秀清.VEGF－C和 VEGFR－3在舌癌组织中的表达及其和肿瘤淋巴转移的关系〔J〕.现代口腔医学杂志，2004，18(5):412.

［7］ 杨 艳，葛荣明.VEGF和VEGF－C在喉癌中的表达及临床意义〔J〕.临床耳鼻咽喉科杂志，2006，16(12):650.

［8］ 曲行舟，王丽珍，胡永杰，等.VEGFR－3在不同临床分期舌癌癌周淋巴管中的表达〔J〕.口腔颌面外科杂志，2007，17(2):123.

［9］ Karpanen T，Wirzenius M，Mäkinen T，etal.Lymphangiogenic growth factor responsiveness is modulated by postnatal lymphatic vessel maturation〔J〕.Am J Pathol，2006，169(2):708.