两种快速细菌菌种鉴定方法的比较

姜艳彬，王 海，侯东军，杨红菊，李 颖，于 雷

（中国动物疫病预防控制中心，北京 100125）

1 引 言

长期以来，对细菌的分类鉴定主要有分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等传统方法，这些方法存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求[1-5]。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。

随着分子生物学技术的发展，逐渐发展了质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因指纹图、16S rRNA序列分析等技术[6]，这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确[7]。

RiboPrinter系统是杜邦公司研发的一种全自动细菌鉴别系统，该系统建立在对核糖体DNA序列多态性分析之上[8]，可以全自动完成细菌鉴定的一系列实验，包括细菌染色体DNA的提取、酶切、电泳、转膜、杂交、曝光、照相、比对分析，通过检测16S-23S-5S rDNA杂交信号而得出基因指纹特征，与数据库比对得出鉴定结果。Riboprinter系统最大化避免了其他因素对实验的影响，且短时、高效，适用于常见细菌的快速鉴定。16S rDNA序列比对分析是较为常用的细菌鉴定方法，当序列同源性大于97%时，可以认定两株细菌属于同一个属，通过后续的生理生化分析可以进一步鉴定至种。

通过Riboprinter全自动核糖体RNA指纹分析系统，进行两株未知细菌菌株CADC-A001和CADC-A003的鉴定，同时与16S rDNA序列分析及生理生化反应实验进行比较。结果表明，两种方法对未知菌种的鉴定结果一致，CADC-A001和CADCA003分别为大肠杆菌和铜绿假单胞菌。相比而言，Riboprinter系统在操作的简便性、结果平行性以及检测速度方面有着更大的便利及优势。

2 材料与方法

2.1 实验材料

CADC-A001和CADC-A003为玛氏食品（中国）有限公司提供的待测菌株，其可以在LB培养基中37℃生长培养；细菌染色体DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Mastermix、DL2000核酸分子量Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；LB培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；通用引物AD007、AD008由上海英骏生物技术有限公司合成；DNA测序由北京华大基因研究中心完成；API 20NE、API 20E细菌鉴定系统购自生物梅里埃中国有限公司；Riboprinter系列耗材购自杜邦Qualicon公司。

2.2 16S rDNA的克隆及序列测定

挑取CADC-A001和CADC-A003单菌落，在LB培养基中37℃培养过夜，各取5mL菌液提取染色体DNA，电泳定量后，用引物AD007和AD008进行PCR 扩增，扩增体系50μL：上游引物 2μL（10mmol），下游引物 2 μL（10 mmol），模版 1 μL（约 50 ng），2×Taq PCR Mastermix 25μL，超纯水 20μL。扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72℃，90 s；重复 2～4步骤，进行 29个循环；72℃，10min。

将扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定，以引物AD007和AD008进行测序。重复PCR及测序3次，以保证测序的准确性，并在NCBI数据库中比对。

2.3 生理生化测定

取CADC-A001单菌落，悬浮于5 mL的0.85%NaCl溶液中，加入API 20E测试板中，37℃培养24h后观察；取CADC-A003单菌落，悬浮于2mL的0.85%NaCl溶液中，取200μL加入AUX培养基，按说明书要求依次加入API 20NE测试板中，30℃培养48 h后观察，与判读表比对获取生理生化信息。

用一次性塑料接菌环挑取单菌落，涂布在湿润的滤纸中央，滴加氧化酶试剂，观察其颜色变化情况，判断待测菌株产氧化酶情况。

2.4 Riboprinter菌种鉴定

用取样棒挑取CADC-A001和CADC-A003单菌落，悬浮于200μL样品缓冲液中，95℃处理25min，加入5 μL裂解液A和裂解液B，放置于Riboprinter样品孔中并运行程序，选用EcoRI酶切系统。杂交图谱选择与Dupont ID数据库进行比对，得出待测菌株信息。

3 实验结果

3.1 CADC-A001和CADC-A003的16S rDNA序列测定

分别挑取平板中的CADC-A001和CADC-A003单菌落，以引物AD007、AD008进行菌落PCR扩增，在1%的琼脂糖凝胶中电泳鉴定，如图1所示。从图中可以看出，扩增产物均为单带，约为1500bp，分别取3管不同扩增产物，以AD007、AD008为测序引物，进行核酸序列测定。测序结果经NCBI数据库比对，CADC-A001的16S rDNA序列与大肠杆菌SE11（NCBI Accession NC001415）、BW2965（NCBI Accession NC012759）、UMN026（NCBI Accession NC011751）和 55989（NCBI Accession NC011748）的16S rDNA序列同源性均达到了99%以上，可以推断其属于埃希氏菌属；CADC-A003的16S rDNA序列与铜绿假单胞菌 LESB58（NCBI Accession NC011770）、PA7（NCBI Accession NC009656）、UCBPP-PA14（NCBI Accession NC008463）、PAO1 （NCBI Accession NC002516）的16S rDNA序列同源性也达到了99%以上，推断其属于假单胞菌属。

图1 CADC-A001、CADC-A003 的 16S rDNA PCR扩增电泳图

3.2 生理生化测定

根据CADC-A001和CADC-A003 16S rDNA测序结果的推断，CADC-A001选用适用肠杆菌的API 20E试剂盒进行各项生理生化指标的测定，在37℃温箱中培养24 h，其结果如表1所示。通过APIWEB软件比对，CADC-A001为一株大肠杆菌，结果可信度为99.5%。CADC-A003选用适用假单胞菌属的API 20NE试剂盒进行各项生理生化指标的测定，在30℃温箱中培养48h后观察，其结果如表2所示。通过APIWEB软件比对，CADC-A003为一株铜绿假单胞菌，结果可信度为99.9%。

表1 菌株CADC-A001的API 20E生化试验结果

表2 菌株CADC-A003的API 20NE生化试验结果

3.3 Riboprinter系统的菌种鉴定

取CADC-A001和CADC-A003平板单菌落，悬浮于200μL缓冲液中，预热后加入裂解液，在Riboprinter系统中自动运行，自动酶切后得出杂交结果如图2所示。

该研究中，两个待测菌株CADC-A001和CADCA003各运行了两个样品，CADC-A001的两个样品一致率达到0.98，CADC-A003的一致率达到0.95（根据测量标准，一致率达到0.90以上，则可以认为是同一个样品），系统有着很好的重复性。

图3（a）为待测菌株CADC-A001和CADC-A003的Riboprinter测定结果。CADC-A001和CADC-A003的杂交图谱显示在RiboprintTMPattern栏中，与Dupont自有数据库比对得出，CADC-A001的两个平行样品与数据库中DUP-14009最为接近，其相似度（Dupont ID Similarity） 分别为 0.94和 0.96，DUP-14009为大肠杆菌（Dupont ID Label中），进一步查阅数据库，DUP-14009为大肠杆菌ATCC-13762。CADC-A003的两个平行样品与Dupont数据库中DUP-11068最为接近，相似度分别为0.95和0.97，DUP-11068为铜绿假单胞菌ATCC-15442。可以推断这两株菌分别为大肠杆菌和铜绿假单胞菌，而且极可能为大肠杆菌ATCC-13762和铜绿假单胞菌ATCC-15442（相似度大于 0.90）。

图2 CADC-A001和CADC-003的Riboprinter杂交图谱

图3

图3（b）是Dupont数据库中与CADC-A001相似度较高的几个菌株，均为大肠杆菌，该研究仅使用Dupont数据库进行了比对，也可以根据自有的数据库进行比对，随着数据库的不断丰富，将有利于菌种的进一步分型、溯源。

4 讨 论

该研究通过Riboprinter全自动菌种鉴定系统分别对两株送测样品CADC-A001、CADC-A003进行了鉴定，并采用16S rDNA序列测定结合生理生化实验进行了对照实验，两种检测方法得出相同结论，CADC-A001为一株大肠杆菌，CADC-A003为一株铜绿假单胞菌。Riboprinter进一步分类表明，CADCA001可能为大肠杆菌ATCC13762，CADC-A003可能为铜绿假单胞菌ATCC15442。

Riboprinter是以DNA指纹为基础的全自动菌种鉴定系统，其通过16S-23S-5S rDNA探针与待测菌株酶切后染色体DNA的杂交图谱，与数据库比对进行菌种鉴定，使大量细菌鉴定步骤获得同步化、标准化，排除了人工操作差异的干扰。相比其他鉴定方法，其优势在于：（1）在整个菌种鉴定过程中，除了取平皿单菌落等最初环节，其他鉴定过程真正达到完全自动化。Riboprinter系统不仅自动提取待测菌株的染色体DNA、完成酶切，还自动进行核酸电泳上样，并转到膜上，自动分子杂交、显色、拍照、运算处理，通过自动比对直接得出待测菌株的种名。（2）鉴定速度快。经过8h即可以完成待测样品的检测，一台机器每天可以完成32个样品的检测。（3）有效地将菌种信息量化，而且可以在鉴定到种的基础上进一步分类，非常适合于菌株的分型及溯源分析[9-10]。

Riboprinter系统也存在一些弊端，主要表现在：（1）只适合于细菌的分类鉴定，且数据库还有待完善。Riboprinter数据库目前涵盖6900余种菌种的杂交图谱，数据库较为全面，其对常见细菌（尤其是食源性致病菌）的检测非常准确，但数据库还有待进一步的丰富。（2）检测的成本相对较高，且每次检测必须同时运行8个样品。

5 结束语

该文通过两种快速检测方法进行了两株未知细菌菌株的鉴定，16S rDNA序列测定结合生理生化实验和Riboprinter全自动菌种鉴定系统均得出了正确的鉴定结果。前者可以在3 d内得到检测结果，而Riboprinter系统则更为快捷，可以在8h内进行未知菌株的鉴定，且操作简单，重复性好，最大限度减少了操作方面的误差，有很大的应用价值。

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