直接涂片法与集菌改良法对抗酸杆菌检出率的比较

王景磊 李俐佳 石凤兰 伍贤鼎

贵阳市第一人民医院检验科，贵州 贵阳 550004

在综合性医院中，结核菌的涂片检查是作为结核病患者的初筛实验，是一种快捷、经济、操作简单的方法，在对结核病患者初筛诊断中起着重要的作用。早发现早治疗，对于患者的康复也是至关重要的，现代结核病控制的基本策略之一就是有效发现和治愈传染源。结核患者的细菌学检查，是发现传染源的最主要途径和手段，是确定结核诊断和治疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准[1]。涂片染色镜检是目前应用最广泛的细菌学检查方法，如何提高痰涂片结核菌检测阳性率，使检测结果更具说服力，本文研究方案是将集菌涂片法加热方式改为恒温水浴箱加热，而通常实验室采用的直接涂片法加热方式仍为酒精灯加热，用这两种不同的检查方法对所收集的痰标本进行涂片染色镜检，现将检测结果报告如下：

1 对象、材料和方法

1.1 对象：采集2009年5月份贵阳市肺科医院结核分枝杆菌室合格的门诊、住院病人痰标本100例，标本不区分初诊、复诊、性别、年龄和肺科医院所检测的阴阳性结果，完全随机。

1.2 标本采集：采取患者清晨深部痰，洁净水或冷开水漱口后，用力咳嗽以获得的合格痰液盛装于蜡盒内，用密封容器带回待检。

分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。

1.3 试剂器材：

抗酸染液：四川省迈克科技有限公司生产的抗酸杆菌染液试剂盒

恒温水浴箱：姜堰市新康医疗器械有限公司，420-A型

离心机：上海安享科学仪器厂，TDL-5-A型

生物安全柜：上海三超净化设备有限公司，SCJC-1300II/B

光学显微镜：OLYMPUS CX21FS1

氢氧化钠：重庆北碚化学试剂厂 分析纯 批号：911114

盐酸：遵义高等师专化学试剂厂 分析纯 批号：860708

酒精：95%乙醇

立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备厂，LSB75L型

1.4 检测方法：(1)新玻片在涂片前在酒精灯火焰上过3次，以达到脱脂目的，待用；(2)将收集来的痰标本先进行直接涂片，涂成2cm×2.5cm椭圆形、圆形、均匀，很少有空白区的厚痰膜三张，待自然干燥；(3)将余下痰液倒入大试管中，加入约2倍体积2%NaOH溶液，加温，37℃消化30min，期间反复摇匀，将上述消化后标本经3000r/min离心30分钟，弃去上清液，取沉淀涂成2cm×2.5cm椭圆形、圆形、均匀，很少有空白区的厚痰膜三张，待自然干燥[2]；(4)上述自然干燥后的痰片经酒精灯火焰固定。

1.5 染色步骤：参照《全国临床检验操作规程》第三版标准。其中直接涂片加热方式采用酒精灯加热，集菌涂片采用将痰片置于55℃～60℃水浴箱中加热[3]，使用四川省迈克科技有限公司生产的抗酸杆菌染液试剂盒，按照说明书进行抗酸染色，干后镜检。

1.6 染液质量控制：采用卡介苗做抗酸染液阳性对照；采用大肠埃希菌标准菌株ATCC 25922做抗酸染液阴性对照。

1.7 结果判断：参照《全国临床检验操作规程》第三版标准判定。涂片染色后，肉眼观察痰膜呈淡蓝色或蓝色，不得有红色斑块，痰膜脱落部分在10%以下，镜下所见，视野背景清晰，100×油镜的视野内于淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色杆菌，其他细菌和细胞呈蓝色。镜下计数100个视野（观察时间不少于4min），未发现抗酸杆菌者继续观察至300个视野，仍未发现抗酸菌者报告抗酸菌阴性（-）；镜检按100-300个视野找到抗酸杆菌1～2条者，报告抗酸杆菌可疑（±），或者重新涂片或另留痰标本复查；镜检100个视野内找到抗酸杆菌3～9条者，报告抗酸杆菌阳性（1+）；镜检10个视野内找到抗酸杆均1～9条者，报告抗酸杆菌阳性（2+）；镜检每个视野内找到抗酸杆菌1～9条者，报告抗酸杆菌阳性（3+）；镜检每个视野内找到抗酸杆菌多于9条以上者，报告抗酸杆菌阳性（4+）为标准，镜检各方法染色涂片三张后综合结果进行记录、统计。

2 结果

2.1 数据统计：

表1 直接涂片与集菌涂片的阳性率比较

由上表可知，集菌涂片改良法阳性检出率显著高于直接涂片法阳性检出率（P＜0.001），两者有显著性差异。

表2 直接涂片与集菌涂片阳性程度比较

上表结果中，集菌涂片法的2+的结果中，＞1+的结果有6例，4+的结果中，＞4+的结果有5例

2.2 显微镜摄影结果对比：

图1

图2

图3

3 讨论

3.1 从结果中可以看出，两种方法相比较有显著性差异（P＜0.001），集菌涂片改良法阳性检出率远远高于直接涂片法，且从数据统计及图片中可看出，在同一份标本中，集菌改良法的阳性程度高于直接涂片法，集菌改良法镜检结果大于直接法镜检结果的共有11例，涂片所示，集菌改良法镜检显示抗酸杆菌数量上有明显提高。由于NaOH的消化作用，使得集菌法的镜下显示背景清晰，与抗酸杆菌的着色有较大反差，更易于辨认（如图示），减少了漏检的机率，增加其阳性检出率。

本文采用两种方法检验的100例痰液标本中，集菌改良法64例阳性中，直接涂片法只有30例阳性，其余均为阴性。两种方法对100例痰检阳性结果相比较，在相同判断标准下，两种方法检出阳性结果只有30例完全相符合，集菌改良法检出的64例阳性结果在直接法中的阳性程度均减少甚至为阴性。

3.2 直接涂片法在实验过程中存在以下几点问题：①涂片时厚片与薄片在镜检时，结果有很大差别；②由于直接法只是挑取痰液进行涂片，是否挑至有效部位（菌量较多处、血性、脓性部分），将对结果有很大影响；③由于痰液直接被涂片，致使染色后，镜下其他细胞较多，在患者带菌量较少时，呈红色的抗酸杆菌可能会与蓝色的其他细胞作为的背景融合，不利于检验人员对抗酸杆菌的识别；④加热不易控制。以上几点均会出现假阴性结果，但其操作简单，耗时较短为其优点。而本文所采用的集菌涂片改良法方式有以下几点优势：①本研究采用的消化液为2%NaOH溶液，该试剂价格便宜，且消化时不需进行高压灭菌处理[4]，大幅缩短了该法的实验耗时；②本研究的方法是针对所采集患者的全部痰液，即采集到的患者痰液全部进行消化处理，消化结束后经3000r/min离心30min处理，使痰液中未被消化的抗酸杆菌充分沉淀；③经此处理后的痰液，沉淀下来的菌量较大，因此该法在涂片时无需区分厚片与薄片；④经消化处理后的痰液液化较充分，除抗酸杆菌外的其他细菌被消化，使染色后，镜下所见背景较清晰，易于检验人员对抗酸杆菌的识别（如图示），提高了阳性检出率，有效避免假阴性结果的出现。但此法相对于直接涂片法操作时间较长、步骤较多。

3.3 抗酸染色法作为结核病细菌诊断的经典方法之一沿用至今，但成功染成一张质量较好的涂片尚有一定难度，制片影响因素较多。

本研究采用两种涂片染色法同时，直接涂片法仍采用酒精灯对痰片进行加热，而集菌改良法加热方式选择为55℃～60℃恒温水浴箱对痰片进行加热，该法在使用时温度恒定，有助于染液与抗酸杆菌的充分结合，使菌体着色较为充分，染色效果较好，配以集菌法的天然优势，使镜下所示，抗酸杆菌的着色与背景颜色有较大的反差，有利于检验人员的识别（如图示），而传统的酒精灯加热，加热时间与温度很难把握，极易造成加热时间过长、温度过高、染液干涸等，这些都将导致菌体变性，直接影响在镜检时的效果。

综上所述，痰液集菌涂片改良法抗酸染色可大幅提高其阳性检出率，配合水浴箱加热法，是一种简单易行、阳性率高的方法，适合在广大综合性医院中作为肺结核患者的初筛试验，对肺结核病患者的早日康复有着重要意义。此外，标本质量也至关重要，一份合格的痰标本，加之阳性率高的检查方法，可更进一步提高痰液中抗酸杆菌的检出，因此，在临床采集标本时应特别注意，这样才可真正达到肺结核患者在非肺科专科医院中的初筛目的。

4 结论

集菌涂片法阳性检出率与直接涂片法阳性检出率有显著性差异（P＜0.001），故集菌涂片改良法可作为非肺科医院结核病的初筛试验。

[1]王钊，吴明江.全国结核病防治手册，1997：27.

[2]汪胖，邵春阳.结核杆菌离心浓集法的改进及临床应用，工企医刊，2001年(第14卷)第4期：5.

[3]胡永林.用水浴蒸汽加热替代火焰加热进行抗酸染色[J].临床检验杂志，2008年(第26卷)第1期：19.

[4]李阳辰，王水亮，许小广.快速集留法查抗酸杆菌的评价[J].中国防疥杂志，1999，(21)：7.

[5]Fodor T Tuberde 1984，65：12.

[6]汪胖，邵春阳.结核杆菌离心浓集法的改进及临床应用[J].工企医刊，2001年(第14卷)第4期：5.