泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜发育的影响

郭长义 蒋宗勇 李 职 林映才 蒋守群 马现永 郑春田

（1.广东省农业科学院畜牧研究所,农业部动物营养与饲料（华南）重点开放实验室,广东省动物育种与营养公共实验室,广州 510640;2.华南农业大学动物科学学院,广州 510642;3.比利美英伟营养饲料（深圳）有限公司,深圳 518103）

精氨酸作为一种碱性氨基酸,在动物体内除参与体蛋白质沉积外,还通过多种酶,如精氨酸酶、一氧化氮合成酶、精氨酸-甘氨酸转脒酶以及精氨酸脱羧酶催化后广泛参与机体代谢,并通过其代谢物在动物体内发挥着重要营养生理效应[1-3],这提示其在猪营养研究中有潜在的应用价值。母猪饲粮精氨酸水平升高对哺乳仔猪生长有显著的促进作用[4-5],外源精胺与胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）等成分对仔猪小肠黏膜发育具有刺激作用[6-11],乳中精胺和IGF-Ⅰ的含量随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而显著升高[12]。本试验旨在研究母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪肠道发育的影响,借以阐明提高母猪饲粮精氨酸水平促进哺乳仔猪生长的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试验设计

试验选择遗传一致,2～4胎、体重、膘情和预产期相近的长大二元杂交经产母猪36头,于妊娠110 d左右进入产房,随机分为0.82%精氨酸组（n=12）、1.23%精氨酸组（n=12）和1.64%精氨酸组（n=12）3个组。各组泌乳母猪饲粮组成及营养水平见表1。饲粮精氨酸水平分别为0.82%、1.23%和1.64%,添加L-精氨酸盐酸盐使饲粮精氨酸含量达到需要的值,添加L-丙氨酸平衡饲粮以保持各组饲粮等氮,其他营养含量均满足或超过NRC（1998）推荐量。L-精氨酸盐酸盐产自湖北省潜江市四维氨基酸有限公司,食品级,纯度为99.7%,含82%的精氨酸。试验从产后第4天开始至第22天断奶时结束。

表1 泌乳母猪饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Com position and nutrient leve ls of lac tating sow diets（air-d ry basis,%）

1.2 饲养管理

母猪分娩当天作为产后第1天,18:00以后分娩的按次日计算,仔猪随母猪饲养在带有保温设施的高床产房里。母猪产后最初几天采用定量限饲的方式进行饲喂,其中第1天、第2天和第3天分别饲喂0.7、1.4和2.1 kg饲粮,第4天和第5天分别饲喂3.1和4.1 kg饲粮,第6天以后自由采食。每日饲喂2次,自由饮水。母猪产后48 h内调整母猪窝仔数达到10头,并于产后第4天清晨根据仔猪体重进行调整,保证各组母猪所带仔猪重量基本一致,试验期间仔猪不补料。

1.3 样品收集和处理

仔猪21日龄断奶,断奶当日清晨,每组选6头接近平均体重的仔猪,共18头。参照秦江帆[13]的方法,所选仔猪屠宰后,切开腹腔取出全部小肠,迅速置入放有双抗的冰冻PBS溶液中。剪开肠系膜,将肠段打开,分别取十二指肠、空肠、回肠各2段,每段2～3 cm。其中1段放入10%的福尔马林固定液中,以备光镜观察;另外1段放入PBS液中,洗净后剪成5 mm左右的小块,放入装有4%戊二醛固定液的小瓶中,以备电镜观察。

接着再取各肠段（十二指肠、空肠、回肠）,剪成5 cm的小段,剖开肠管,冰冻PBS液冲洗干净后,用定性滤纸将黏膜表面的PBS液吸干,用载玻片将肠黏膜轻轻地刮下来,1.5 m L离心管分装后液氮保存,待测。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 哺乳仔猪小肠黏膜绒毛结构的光镜和电镜观察

光镜观察前,取出组织样,经修整、水洗、脱水、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片,苏木精-伊红染色,光镜下观察并拍照。利用JD801形态学图像分析系统,统计小肠黏膜绒毛高度及隐窝深度。

电镜观察前,取出组织块,用PBS漂洗3次,每次15min,然后用1%锇酸固定1 h,再次用PBS漂洗3次,每次10 m in。接下来用酒精梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%）各2次,每次10 min。100%酒精第2次脱水后加入无水硫酸铜,再用醋酸正戊酯转化2次,每次15 m in,CO2临界点干燥。装台,粘样,IB-5离子溅射仪喷金,用XL30ESEM电镜扫描,观察并拍照。

1.4.2 哺乳仔猪小肠黏膜组织预处理

取组织样0.4 g,加3.6m L预冷PBS液,组织匀浆器间歇性匀浆40～60 s（以上操作在冰浴中完成）。离心（4℃,3 000 r/m in,10 m in）,取上清液即为10%组织匀浆上清液,备测。

1.4.3 哺乳仔猪小肠黏膜组织蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 哺乳仔猪小肠黏膜组织乳糖酶与碱性磷酸酶活性的测定

乳糖酶与碱性磷酸酶活性采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所,根据说明书进行操作。

1.4.5 哺乳仔猪小肠黏膜组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的测定

GSH-Px、SOD活性和MDA含量采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所,根据说明书进行操作。

1.5 数据统计与处理方法

全部数据采用SAS 8.1 GLM程序进行方差分析,用Duncan氏法进行多重比较,并进行回归分析,设定P＜0.05为差异显著。所有数据均以平均值±标准误（mean±SE）表示。

2 结 果

2.1 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜绒毛形态的影响

表2结果显示,哺乳仔猪各肠段黏膜绒毛高度均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而升高,其中十二指肠黏膜绒毛高度与泌乳母猪饲粮精氨酸水平呈线性相关,其回归方程为:y=50.166x+549.06 （r=0.49,P＜0.05）;各组间空肠和回肠黏膜绒毛高度差异均不显著（P＞0.05）。哺乳仔猪各肠段黏膜隐窝深度均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而下降,十二指肠、空肠和回肠黏膜隐窝深度均与泌乳母猪饲粮精氨酸水平呈线性相关,其回归方程依次为:y=-17.083x+204.184（r=0.47,P＜0.05）,y= -37.961x+186.044（r=0.56,P＜0.05）,y= -51.602x+188.168（r=0.57,P＜0.05）。

表2 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠绒毛高度和隐窝深度的影响Table 2 Effects of dietary arginine levels of lactating sows on the villous height and crypt depth of sm all intestine in suck ling piglets（μm）

由图1至图3可以看出,随母猪饲粮精氨酸水平的升高,十二指肠黏膜绒毛密集度趋于增加,空肠黏膜整齐度改善,回肠无明显变化。

2.2 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜乳糖酶和碱性磷酸酶活性的影响

如表3所示,哺乳仔猪各肠段黏膜乳糖酶活性均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而升高,其中十二指肠和空肠黏膜乳糖酶活性与泌乳母猪饲粮精氨酸水平呈线性相关,其回归方程分别为:y=23.5x+ 135.846（r=0.56,P＜0.05）;y=34.939x+ 113.638（r=0.58,P＜0.05）;各组间回肠黏膜乳糖酶活性差异不显著（P＞0.05）。哺乳仔猪各肠段黏膜碱性磷酸酶活性均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而升高,其中十二指肠和空肠黏膜碱性磷酸酶活性与泌乳母猪饲粮精氨酸水平呈线性相关,其回归方程分别为:y=43.162x+262.809（r=0.56,P＜0.05）,y=48.537x+249.178（r=0.50,P＜ 0.05）。各组间回肠黏膜碱性磷酸酶活性差异不显著（P＞0.05）。

表3 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜乳糖酶和碱性磷酸酶活性的影响Table 3 Ef fec ts o f dietary arginine levels of lactating sows on lactase and alkaline phosphatase activities of small intestinalmucosa in suck ling piglets（U/g prot）

2.3 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影响

如表4所示,哺乳仔猪十二指肠、空肠和回肠黏膜GSH-Px活性均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而升高,并且呈线性相关,其回归方程依次为:y= 5.914x+10.884（r=0.82,P＜0.05）;y=3.84x+ 10.667（r=0.53,P＜0.05）;y=2.015x+11.587 （r=0.56,P＜0.05）。哺乳仔猪各肠段黏膜SOD活性均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而升高,并且呈线性相关,其回归方程依次为:y=2.173x+ 12.633（r=0.68,P＜0.05）;y=1.561x+12.463 （r=0.53,P＜0.05）;y=1.53x+10.394（r= 0.48,P＜0.05）。哺乳仔猪各肠段MDA含量均随泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高而降低,其中十二指肠和空肠黏膜MDA含量与泌乳母猪饲粮精氨酸水平呈线性相关,其回归方程依次为:y=-0.231x+ 0.913（r=0.61,P＜0.05）;y=-0.246x+0.924 （r=0.61,P＜0.05）;各组间回肠黏膜MDA含量差异不显著（P＞0.05）。

表4 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜GSH-Px、SOD活性和M DA含量的影响Tab le 4 Effects of dietary arginine levels of lac tating sows on GSH-Px,SOD activities and MDA content o f small intestinalmucosa in suck ling piglets

3 讨 论

3.1 泌乳母猪饲粮精氨酸水平对哺乳仔猪小肠黏膜绒毛形态的影响

小肠绒毛是营养物质消化吸收的主要部位,其绒毛高度变化显示小肠上皮细胞的功能状况,而隐窝深度则显示上皮细胞的增殖状况,这2个形态学指标作为仔猪小肠发育和成熟的主要标志被广泛研究和采用[14-15]。此外,通过电镜观察可以更为直观地对小肠形态结构的完整性和发育程度进行观察。

本研究对哺乳仔猪小肠黏膜绒毛高度与隐窝深度进行了分析测定,结果表明,增加泌乳母猪饲粮精氨酸水平可以提高哺乳仔猪小肠黏膜绒毛高度,同时降低其隐窝深度。该结果提示,提高泌乳母猪饲粮精氨酸水平能够增加哺乳仔猪小肠黏膜成熟细胞的数量和小肠黏膜的表面积,有效促进哺乳仔猪小肠发育和成熟。电镜观察显示,与0.82%精氨酸组相比,1.23%和1.64%精氨酸组哺乳仔猪小肠黏膜绒毛多而整齐,提示其有更好的发育状态。究其原因,可能与乳中包括精胺与IGF-Ⅰ在内的多种活性分子含量增加有关,后者能促进哺乳仔猪小肠发育和成熟。程志斌[11]报道仔猪口服精胺能够增加小肠重量,提高空肠和回肠黏膜蛋白质含量以及DNA、RNA浓度。Buts等[16]报道口服精胺可以增加大鼠小肠长度和重量,提高黏膜重量和DNA含量。腐胺可以为小肠提供能量,并且已经证实腐胺对小肠发育的影响是间接效应,即外源腐胺进入小肠黏膜上皮细胞后代谢为精脒和精胺,进而促进小肠成熟[17-19]。除此之外,口服IGF-Ⅰ能显著增加仔猪小肠重量、DNA和RNA浓度以及空肠和回肠绒毛高度[9-10],并能提高仔猪小肠吸收养分的能力[6-8]。

3.2 泌乳母猪饲粮精氨酸水平影响哺乳仔猪小肠黏膜机能的作用机理

小肠是动物体内最重要的消化器官,其中消化酶活性最能反映其消化机能。较早对小肠消化酶活性发育的研究,主要以黏膜层消化酶活性变化为衡量指标,其原因之一是小肠乳糖酶、麦芽糖酶和碱性磷酸酶等水解酶主要定位于绒毛刷状缘,而并不分泌至肠腔[20-22]。母乳是新生仔猪唯一的食物来源,而乳糖是母乳中最为重要的碳水化合物,因此乳糖酶的成熟对新生仔猪消化机能显得特别重要。肠上皮细胞刷状缘分布的碱性磷酸酶主要作用是催化多种磷酸单酯的水解,此外还与分泌型免疫球蛋白（SIgA）、杯状细胞分泌的黏液组成动物与外界的一层屏障,阻止绝大多数外来致病原侵入。因此检测小肠黏膜乳糖酶和碱性磷酸酶的活性可以在一定程度上反映小肠黏膜的消化机能。本研究对哺乳仔猪小肠黏膜中的乳糖酶和碱性磷酸酶活性进行了分析测定,结果表明,增加泌乳母猪饲粮精氨酸水平能够提高哺乳仔猪小肠黏膜乳糖酶和碱性磷酸酶的活性。鉴于已有的报道均表明口服精胺降低乳糖酶的活性[11,16],因此本试验中乳糖酶活性的提高原因可能是由于母猪饲粮精氨酸通过影响母乳中IGF-Ⅰ等活性成分,刺激了肠腺的发育与成熟,从而增强了该酶的活性,为仔猪有效消化吸收营养物质提供支持。Young等[23]报道IGF-Ⅰ可提高大鼠肠黏膜乳糖酶的活性。H artke等[24]研究发现,给仔猪口服IGF-Ⅰ可以使乳糖酶水解酶活性增加18%,蔗糖酶活性增加45%。H oule等[10]报道,初生仔猪每天摄入200mg/kg重组人IGF-Ⅰ,7 d后在近端和中端回肠乳糖酶活性提高2倍,蔗糖酶活性提高50%。

小肠上皮细胞在新陈代谢过程中,会不断产生活性氧代谢物——自由基,当自由基产生过多时,超过机体清除氧自由基的能力,即诱发氧化应激,引起脂质、蛋白质和DNA的过氧化,最终导致组织、器官的损伤[25]。小肠对氧自由基的损伤极为敏感,肠黏膜含有高浓度的非蛋白质巯基,氧自由基作用于巯基使蛋白质变性、酶失活,氧自由基与膜内多不饱和脂肪酸结合造成脂质过氧化损害,损伤肠黏膜组织,这种损伤不仅降低肠细胞的吸收能力,还将导致膜的通透性加大,造成肠道细菌和内毒素移位,病原菌侵入的增加,使得巨噬细胞在吞噬过程中释放活性氧数量增加,生成的O2-可使酶类及非酶类的物质还原并可产生反应性更高的活性氧[26]。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化系统成员,能清除超氧阴离子自由基（AOR）,保护细胞免受损伤[27-30]。脂质过氧化物MDA是由活性氧以及由之触发的脂质过氧化的终末产物,反映机体内脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度[31]。因此,检测SOD、GSH-Px的活性和MDA的含量,可以反映机体清除自由基的能力及细胞受损的严重程度。本试验分别对小肠黏膜GSH-Px、SOD活性和MDA含量进行了检测,结果表明,与0.82%精氨酸组相比, 1.23%和1.64%精氨酸组哺乳仔猪小肠GSH-Px和SOD活性明显升高,而MDA含量有所下降,说明泌乳母猪饲粮精氨酸水平升高增强了哺乳仔猪小肠黏膜抗氧化保护能力,其机理可能与乳中精胺和IGF-Ⅰ含量增加有关。Farbiszewski等[32-33]研究证实精胺对机体抗氧化酶有保护作用,而García-Fernández等[34-35]也发现IGF-Ⅰ能够减少自由基对机体的氧化损伤。尽管目前尚未见到乳源精胺和IGF-Ⅰ改善仔猪肠道抗氧化机能的报道,但本试验结果一定程度上说明了提高泌乳母猪饲粮精氨酸水平,可以通过增加乳中精胺和IGF-Ⅰ的含量来改善哺乳仔猪体内如小肠黏膜抗氧化机能,进而促进小肠黏膜的正常发育。

4 结 论

①提高泌乳母猪饲粮精氨酸水平改善了哺乳仔猪小肠黏膜绒毛高度,降低了隐窝深度。

②提高泌乳母猪饲粮精氨酸水平显著提高哺乳仔猪小肠黏膜乳糖酶和碱性磷酸酶的活性,增加哺乳仔猪小肠黏膜GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:jiangz38@hotmail.com

（编辑 田艳明）