饲醋大鼠血清对人肺腺癌细胞株A549抑制作用的实验研究

王 勉，张 旭

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

肺癌是严重威胁人类生命与健康的常见恶性肿瘤之一，发病率和死亡率一直呈不断上升趋势。肺癌的发病机制十分复杂，近年来认为细胞增殖和凋亡失衡可能在肿瘤的发生发展中起重要作用。流行病学资料表明，食醋可能具有防癌抗癌作用。本研究旨在探讨饲醋大鼠血清对人肺腺癌A549细胞的诱导凋亡作用，为食醋防癌抗癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人肺腺癌A549细胞，购于中国医学科学院肿瘤医院；A549细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养，培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640，含1%三抗（青霉素、链霉素、两性霉素），待细胞生长至对数生长期后进行实验。MTT，华美生物技术有限公司，用PBS配制成5mg/ml，-20℃保存备用；碘化丙啶（PI），Sigma公司；Annexin Ⅴ-EGFP试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 制备饲醋大鼠血清

1.2.1 实验动物分组及处理：6周龄SD大鼠50只，雌雄各半，体重150-200g，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号：812097。大鼠随机分为饲醋组和对照组，每组25只，分别喂以含醋饲料、含醋饮水和普通饲料、普通饮水4个月。

1.2.2 饲料：普通饲料购于北京维通利华实验动物技术有限公司；醋中王，山西水塔老陈醋集团生产，食醋产品总酸度≥6g/100ml；含醋饲料组成（30ml醋：100g普通饲料）；含醋饮水组成（5ml醋：100ml清洁饮水）。

1.2.3 制备血清：大鼠饲养4个月，隔夜禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，37℃温浴1h后，3000r/min离心10min，分离血清，56℃水浴30min灭活血清，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，-20℃保存备用。

1.3 MTT法检测饲醋大鼠血清对A549细胞的生长抑制作用 取对数生长期A549细胞，以1×104/孔密度接种于96孔板，培养12h后，分别施加以下处理：对照组（N组），含20%普通饲养大鼠血清的1640培养基；实验组（V组），含20%饲醋大鼠血清的1640培养基；顺铂组（D组），含3mg/L顺铂的10%胎牛血清1640培养基；空白对照组（NN组），含10%胎牛血清的1640培养基。每组设6个复孔，处理后分别培养24、48、72、96h后，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h，吸净原培养液，加入二甲亚砜（DMSO）150μl/孔，振荡10min，用酶标仪（检测波长：490nm）测定每孔的OD值，计算抑制率。抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%，均以NN组为对照组。

1.4 流式细胞仪检测饲醋大鼠血清对A549细胞凋亡的影响 取对数生长期A549细胞，0.25%胰酶消化后，取2×105个细胞接种于培养瓶，培养12h后按1.3的方法分组。培养48h后分别收集细胞进行细胞凋亡率检测：①调整细胞浓度为1×107/ml，取细胞悬液10μl，分别用AnnexinⅤ-EGFP及PI双染，室温避光15min，检测A549细胞早期凋亡。②取2-3×106个细胞，用70%乙醇固定24h，PBS洗净乙醇，加入40μl磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，离心，弃上清，PI染色，室温避光30min，流式细胞仪检测A549细胞晚期凋亡。

1.5 统计方法 采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 饲醋大鼠血清对A549细胞增殖的抑制作用 见附图。MTT法结果显示,饲醋大鼠血清能明显抑制A549细胞的生长，且呈时间依耐性，随用药时间的延长，抑制率明显上升（P＜0.05）。相同时间点，实验组与对照组、顺铂组比较差异显著：实验组的抑制率明显高于对照组，低于顺铂组（P＜0.05）。

附图 人肺腺癌A549细胞抑制率曲线

2.2 饲醋大鼠血清对A549细胞凋亡的影响 饲醋大鼠血清处理48h后，实验组A549细胞凋亡率较对照组和空白对照组显著提高,但明显低于顺铂组（P＜0.01）。表明饲醋大鼠血清有促进或诱导A549细胞凋亡的作用（见附表）。

附表 人肺腺癌A549细胞调亡率（%）

3 讨论

食醋是生活中常用的调味品，在我国古代就有“治百病”之说，被誉为“百药之长”。中医认为食醋可“消肿痛、散水气、杀邪毒、理诸药、解诸毒”。据明代李时珍本草纲目记载，食醋能破血运，消食，杀恶毒，破结气。近年的流行病学研究结果表明，酿醋厂工人、厂区及周围数十年少有癌症患者发生[1,2]。国内外的一些研究也表明，食醋具有抗肿瘤活性，具有防癌抗癌作用[2-4]。

自日本学者田真代一于1988年提出血清药理学的概念和实验方法以来，近年来，中外学者在血清药理学方面做了大量的研究工作[5]。目前，血清药理学的方法已被广大学者接受，成为体外实验的重要方法。本实验采用血清药理学方法，用饲醋大鼠血清（灭活）代替传统肿瘤细胞培养液中的小牛或胎牛血清培养肿瘤细胞，观察其对人肺腺癌A549细胞的影响。

本研究结果表明，饲醋大鼠血清能明显抑制A549细胞增殖，且呈现时间依赖性；能显著增强A549细胞凋亡。细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是指细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身程序，通过自我调控，主要是通过内源性DNA内切酶的激活结束自己生命的过程[6]。细胞凋亡与肿瘤发生及抑制密切相关。一些肿瘤化疗药物、热疗及放疗都是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用的，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的新思路[7]。长期饲醋大鼠血清能通过抑制A549细胞增殖或诱导A549细胞凋亡而明显抑制A549细胞生长。本研究结果一方面可能为食醋防癌抗癌提供科学依据；另外，也为探讨食醋防癌抗癌的可能机制提供途径，即通过促进或诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长，但诱导凋亡的具体机制有待进一步研究。

[1]冯子道，安智珠.保宁醋中化学成分和保宁醋厂环境中微量元素抗癌性的初步研究[J]．四川环境，1984，（4）：1-9.

[2]霍君生.食醋的医疗保健功能（上篇）[J]．调味与保健，1999，（2）：30-31.

[3]Nishidai S, Nakamura Y, Torikai K, et al. Kurosu, a traditional vinegar produced from unpolished rice, suppresses lipid peroxidation in vitro and in mouse skin[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2000,64（9）:1909-1914.

[4]王明福.食醋与保健[J]．中国酿造，1998，（6）：39-40.

[5]田真代一“.血清药理学”と“血清药化学”—汉方の药理学がぃ始まつた药物血中浓度测定の新しぃ世界[J]．TDM研究，1988，（5）：541.

[6]李超，伏圣博，刘华玲．细胞凋亡研究进展[J]．世界科技研究与发展，2007，29（3）：45-53.

[7]Ko WG, Kang TH , Kim NY, et al. Lavandulyl flavonoids:a new class of in vitro apoptogenic agents from Sophora flavescens[J].Toxico In Vitro, 2000, 14 （ 5 ） :429-433.