农药和化肥对无尾两栖类蝌蚪的毒性效应研究进展

李贞，李丕鹏，徐齐艳，陆宇燕，*

1.沈阳师范大学中国两栖爬行动物保护与繁育研究中心辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳110034

2.辽宁省肿瘤医院，沈阳110042

农药和化肥对无尾两栖类蝌蚪的毒性效应研究进展

李贞1，李丕鹏1，徐齐艳2，陆宇燕1，*

1.沈阳师范大学中国两栖爬行动物保护与繁育研究中心辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳110034

2.辽宁省肿瘤医院，沈阳110042

以两栖动物研究环境污染物的毒性效应进而监测环境的变化，已成为国内外的研究热点.两栖类的胚胎发育和变态过程对水的依赖性极强，而且鳃和皮肤有很强的渗透性，当其受到污染胁迫时，在细胞、组织及生理生化水平上都会发生显著变化，进而会影响其存活和生长发育.在总结国内外相关研究基础上，综述和分析了农药、化肥（氮肥）对无尾两栖类蝌蚪的行为表现、生长发育、组织结构和生理生化变化等方面的毒性效应，以期为农药、化肥的水环境监测及合理使用提供全面的科学依据.

蝌蚪；化肥；农药；环境监测

近20年来，世界范围内两栖动物种群数目急剧减少及畸形蛙大量出现的现象提示水环境污染已成为威胁其生存的主要因素之一（Blaustein et al.,1994;Wake,1991;牛海岗等，2009）.水生毒理学的研究，以往主要集中在鱼类和水生无脊椎动物，近年来的研究指出：无尾两栖类的幼体——蝌蚪，由于其在变态前有外鳃暴露于水环境、其皮肤缺少保护结构致使具有较高的渗透性，水环境中的污染物能较快地在其体内大量富集，因此被广泛用作指示生物进行水体有害物质及水质的监测，并取得了较好的效果（周景明等，2006;Stansley et al.,1992;Mann et al.,2009）.

近年来，随着农产品需求量的不断增加，农业生产中各种农药和化肥的施用量也在不断增加.由于产品剂型、施用方法及超量使用等原因，农药、化肥在增产的同时也对环境带来了严重的负面效应.利用无尾两栖类蝌蚪研究农药、化肥的毒性效应进而监测其对环境的影响，已成为近年来国内外研究的热点（Hyaes et al.,2003;Ortiz-Santaliestra and Sparling,2007;De Wijer et al.,2003;吕秀芬，1989;南旭阳等，2000;苑宇哲等，2005;丁道韧等，1992;苗德志和李松梧，2007）.

本文以无尾两栖类蝌蚪的活动行为、胚胎发育及生长发育、组织结构和生理生化变化等作为生物学指标，对农药、化肥对其的毒性效应进行了综述，以期为农药、化肥的水环境监测及合理使用提供全面的科学依据.

1 农药污染及其对蝌蚪的毒性效应

1.1 农药污染源

目前我国农药使用中存在的突出问题是使用不合理（王雪芳，2004），严重破坏了农业生态环境，主要表现在：1）大多数农药直接喷洒于农作物表面，其中仅有10%左右药剂被吸收，而大部分农药则随大气流动或雨水流失.大气中的农药分子与人体皮肤和眼睛粘膜等接触，或通过呼吸道吸入可引起疾病，严重的会导致急性中毒、慢性中毒，甚至致癌；有些持续性有机污染物甚至已污染到了两极地区.2）农药喷施时，部分农药粗颗粒、粉粒落入土壤中,大气中的农药颗粒也会沉降进入土壤中，这些农药在土壤中的分解缓慢，而数量又在不断增加，导致土壤物理化学性质的改变，进而直接影响作物的生长；3）土壤中农药残留量及衍生物含量增加，对土壤中有益的动物及微生物具有明显的危害，降低了土壤的生物活性，破坏了土壤的生态环境；4）土壤中的农药被灌溉水、雨水冲刷到江河湖海中，污染水源，造成水生生物的大量死亡，同时也使渔业和养殖业遭受到经济损失（邱小燕，2008）.

1.2 农药对无尾两栖类蝌蚪的毒性效应

由于农药的有效成分均具有一定毒副作用，在无尾两栖类的栖息地水域受农药污染后，必将导致在卵孵化及后期的发育和变态中出现不同程度的损伤，故表现出较高的死亡率和某些生理缺陷的发生.

1.2.1 对蝌蚪的活动行为和存活率的影响

在对有机磷农药（二嗪磷）染毒的卞氏皱蛙（Ptychadena bibroni）蝌蚪的观察中发现，随着农药浓度的升高，蝌蚪表现出逐渐强烈的回避反应，即呈现不正常的游泳姿态，躯体作剧烈的扭动；随着染毒时间的延长，蝌蚪对触动的反应逐渐迟钝.暴露于梯度浓度的二嗪磷溶液中两周的蝌蚪，死亡率随着浓度的升高而升高，在25μg·L-1中蝌蚪的死亡率高达75%（Ezemonye and Ilechie,2007）；而与有机磷农药有相近作用的有机氯农药（DDT）对蝌蚪染毒情况的报道中，也指出其可以引起蝌蚪“多动症”（Sparling et al.,2001）.对于这两种农药的作用机理，目前认为：农药通过与蝌蚪乙酰胆碱酯酶的酯解部位结合，致使该酶失活，从而使乙酸胆碱积聚，引起胆碱能神经先兴奋后抑制的一系列神经系统症状（黄伯俊，1993;Berrill et al.,1998;Broomhall,2005），神经系统的紊乱直接导致蝌蚪运动异常的发生，以及蝌蚪最后的死亡.

1.2.2 对胚胎发育和胚后发育的影响

在无尾两栖类个体发育过程中，农药对其有显著影响.首先，农药对蝌蚪有致死效应，但是致死率会受发育期的影响.通常孵化期、开口期对农药刺激的敏感性较强，而孵化期之前、开口期之前及开口期之后的敏感程度均小于这两个特殊时期，而在上述三者之间，孵化期的死亡率最低（卢祥云等，2002）.此种情况与不同发育时期的特点有关，孵化期胚胎脱离了卵胶膜的保护作用，致使农药成分可直接渗透进入正在发育中的胚胎，故死亡率明显提升；而到开口期后，蝌蚪开始了主动吞咽动作，农药溶液随水流进入蝌蚪消化道，又一次导致了死亡率的攀升.而经过了孵化期与开口期的“选择”存活下来的蝌蚪，可通过自身的应激修复表现出一定的适应性（Pilar Honrubia et al.,1993），这种能力存在着明显的个体差异.其次，农药对蝌蚪具有显著的致畸效应.如部分农药可引起蝌蚪代谢受阻导致其体内的渗透压改变，引起胚体水肿，表现在：蝌蚪尾部和躯体出现明显扭曲，腹部膨大呈透明状，四肢发育不健全（Bridges,2000）；由于蝌蚪体壁结构简单，而其神经系统及脊索（柱）又位于体背部的表层，故极易受到农药成分的浸蚀，进而引起神经系统及脊索（柱）发育的异常，导致蝌蚪出现扭曲（Bridges,2000;杨晓梅等，2001）.最后，农药对蝌蚪的体重、体长也有显著影响.如黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）蝌蚪在较高浓度的除草剂稻草隆溶液里，反应敏感，摄食活动相对频繁，在蝌蚪的体重、体长的数值上远远超过对照组（刘木养等，2006）；而斑腿泛树蛙（Polypedates leucomystax）蝌蚪在较高浓度的农药溶液中却表现出明显的生长抑制现象（姚丹，2005;吕秀芬，1989），这种毒性效应的差异可能是由农药种类及其毒性机制不同以及物种差异所致.

1.2.3 对组织结构的影响

鳃是蝌蚪与外界进行气体交换的器官，由于鳃丝及其内毛细血管的结构相当简单，故其对水环境中毒物具有极强的敏感性.农药可导致蝌蚪鳃结构损伤.如在对伊比利亚绿蛙（Rana perezi）蝌蚪的观察中，发现氨基甲酸酯类杀虫剂（ZZ-Aphox）染毒第1天的蝌蚪鳃上皮细胞部分萎缩退化呈不连续状态，但由于刺激了蝌蚪自身的应激机制，使上皮细胞粘液分泌增多，故经一段时间后结构呈恢复趋势（Pilar Honrubia et al.,1993）.

肝脏是蝌蚪重要的解毒器官，在农药作用下，蝌蚪肝脏结构与功能受损.主要表现在：肝脏外观颜色变浅、肝细胞排列紧密、肝血窦增大、可见局部区域出现坏死现象、脂滴及糖原堆积、线粒体数量减少等（Pilar Honrubia et al.,1993）.农药在蝌蚪体内代谢过程及蝌蚪的应激过程中均会产生较多的活性氧自由基，其可引起细胞结构（主要的膜性结构）的损伤，同时也可激活肝脏内有关抗氧化酶及一些代谢酶的活性，引起肝细胞代谢的异常（Pilar Honrubia et al.,1993;姚丹，2005;刘阳，2006）.

农药同样可影响蝌蚪另一个与解毒排毒有关的器官——肾脏.如在经敌敌畏染毒暴露10天后，斑腿泛树蛙（Polypedates leucomystax）蝌蚪肾脏明显萎缩，体积显著缩小（p＜0.01）（姚丹，2005），蝌蚪肾脏受损进而造成代谢废物排泄障碍，死亡率上升.

除此之外，水环境中的农药可通过蝌蚪皮肤的渗透，作用于分化中的生殖原基，导致蝌蚪性腺发育缺陷，严重影响两栖类个体的正常繁殖功能，同时也导致畸形个体的增长，这是导致两栖动物物种衰退的重要原因（Daughton and Tenres,1999;Hayes et al.,2003;Reeder et al.,1998;Sower et al.,2000）.

1.2.4 对抗氧化系统的影响

生物体在长期进化过程中，形成了一套完整的抗氧化系统，用于清除体内多余的活性氧.抗氧化酶作为抗氧化系统的重要组成，在诊断环境污染问题中发挥着重要的生物指示作用.动物体内的抗氧化酶主要包括：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物（GSH-PX）和谷胱甘肽（GSH）等.当生物体遭受氧化胁迫时，其抗氧化酶就会被诱导或抑制（刘硕和周启星，2008）.

以不同浓度的阿特拉津、敌百虫、敌敌畏等溶液对无尾两栖类蝌蚪进行染毒，其抗氧化系统变化均表现出相似规律：在较低浓度时抗氧化酶（SOD和CAT）作用不明显，或具有一定的诱导作用，而在高浓度时却表现出极显著的抑制作用（谢文平和马广智，2003;杨丽华等，2003;苑宇哲等，2004;侯亚妮，2007;耿保荣等，2006）.这种双向作用的机理可能是当蝌蚪机体中活性氧产生初期，诱导了机体应激反应，抗氧化酶活性升高；而当氧自由基大量产生并累积后，会导致抗氧化酶系的酶变性，从而降低了其活性，也有可能是通过使SOD合成酶失活或是酶的转录或翻译途径受阻所致，具体的作用机制有待于进一步探讨.

1.2.5 对遗传物质的影响

农药对无尾两栖类蝌蚪的遗传毒性已被大量实验证实.由于蝌蚪的红细胞较大且易于观察，因此蝌蚪红细胞微核被广泛用于水环境中农药遗传毒性的检测，并获得了较好的效果（Békaert et al.,1999;Hooftman and De Raat,1982;Grinfeld et al.,1986;Jaylet et al.,1986;汤新慧，1999;南旭阳，2000;周雪瑞等，2005;苑宇哲等，2005）.研究表明：农药会诱导蝌蚪红细胞微核及核异常产生，使微核率及核异常率显著升高（封少龙等，2004）.Feng等（2004）采用微核试验及彗星试验研究了两种新型杀虫剂（Imidaeloprid和RH-5849）对黑斑蛙（Rana nigronaculata）蝌蚪及成体血细胞的遗传毒性，发现当Imidaeloprid和RH-5849的浓度分别为8mg·L-1和40mg·L-1时，蝌蚪血细胞微核率比对照组有显著提高；而浓度分别为0.05mg·L-1和5mg·L-1时，对黑斑蛙成体红细胞DNA就有极显著的损伤作用，且具有明显的剂量-效应关系.钟碧瑾等（2009）采用微核试验和单细胞凝胶电泳技术研究发现三唑磷暴露下沼水蛙（Hylarana guentheri）蝌蚪微核率和核异常率显著升高.蝌蚪细胞微核率的高低与农药剂量、处理时间、细胞有丝分裂的速度等因素有关（王蕊芳等，1996;苑宇哲等，2005;楼允东和吴萍，1996;孟顺龙等，1996）.

2 化肥污染及其对蝌蚪的毒性效应

2.1 化肥污染源

化肥是农业生产最基础且最重要的物质投入，主要包括单元素化肥如氮肥、磷肥、钾肥和由两种至三种元素混合组成的复合肥.据联合国粮农组织（FAO）统计，化肥在对农作物增产的总份额中约占40%～60%.尽管化肥在农业发展中有着不可替代的作用，但由于其使用量逐年增加，使土壤无机化现象愈加严重.据报导农作物对氮肥的综合利用率仅为20%～30%，其余部分则渗透到浅层地下水，或随雨水、灌溉用水流入地表水体中溶解形成N，不断的累积导致水体氮素含量过高，引起水体的富营养化.而N在生物体内被还原成N，其可将血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，从而使血红蛋白的载氧能力下降，诱发高铁血红蛋白血症，严重时使生物窒息死亡；同时水体的富营养促进了藻类的大量繁殖，致使水中的溶氧量降低，引起水质恶化进而也会威胁到其他水生生物的正常生存（苗德志和李松梧，2007）.近年来两栖类动物数量的大量衰退可能也与此原因有关（Watt and Jarvis,1997;Rouse et al.,1999）.各种化肥中，氮肥用量最大，且对水体的污染最为严重，因此目前有关化肥对无尾两栖类蝌蚪的毒性效应研究主要以氮肥为主.

2.2 氮肥对无尾两栖类蝌蚪的毒性效应

2.2.1 对活动行为的影响

硝酸盐类化肥对蝌蚪的毒性效应首先表现在行为异常方面（Baker and Waights,1993）.欧洲蟾蜍（Bufo bufo）蝌蚪接触硝酸铵化肥溶液初期表现出无方向性的剧烈游动，且身体扭曲，但放回清水活动异常的现象逐渐减轻甚至消失；染毒6天后，蝌蚪出现勾尾、打圈游动；随着浓度升高或时间延长，出现摄食率降低、游动无力且不平衡、碰触反应迟钝、体表黏液增多，最后蝌蚪活力明显降低直至瘫痪而死.本实验室对磷酸二铵染毒花背蟾蜍（Bufo raddei.）的观察也证明了这一点，同时发现刚开始染毒的蝌蚪还有明显的排便量增加的现象.造成这些现象的原因可能是多方面的，蝌蚪在主动吞咽作用时氮肥溶液进入其消化道，影响了肠道中的有益共生菌群，导致其消化功能异常，而表现出摄食频率的降低（Hecnar,1995）；此外，氮肥可能通过渗透作用造成神经系统的损伤，进而引起了蝌蚪运动方式的异常，并改变了蝌蚪对环境的敏感性（Xu and Oldham,1997）；而蝌蚪体内的NO2-引起的血红蛋白携氧能力快速降低，最终影响蝌蚪的各种生理功能，导致其死亡（Train,1979）.

2.2.2 对存活率的影响

氮肥对蝌蚪的致死效应较为复杂.首先，不同物种蝌蚪对化肥的敏感程度不同（Geiffis-Kyle and Ritchie,2007;Hecnar,1995;XuandOldham,1997）.其次，不同化肥对同种蝌蚪的致死浓度也存在明显差异，如碳酸氢铵对黑斑蛙（Rana nigronaculata）的致死浓度几乎是尿素的48倍（丁道韧等，1992）.最后，氮肥的致死效应受蝌蚪发育期的显著影响，如用同浓度的硝酸铵化肥溶液处理锄足蟾（Pelobates cultripes）蝌蚪4天，新孵化的个体几乎全部死亡，而发育期较晚的蝌蚪死亡率则不到40%（Ortiz-Santaliestra et al.,2006），此现象说明蝌蚪不同发育期可能对化肥的敏感程度存在显著差异.现有实验结果均提示由于蝌蚪在不同发育时期具有不同的形态结构、生理功能，导致其对外界环境因素刺激的反应不同，在农业生产中对化肥的使用，应结合蝌蚪的发育时间合理安排，调整使用浓度、使用时间或种类，从而在保证农作物对肥料需求基础上，尽可能地避开在蝌蚪发育的“脆弱”阶段使用对蝌蚪伤害大、或者超出蝌蚪最大耐受浓度的使用量.

2.2.3 对生长发育和免疫系统的影响

氮肥可引起蝌蚪发育畸形（Marco and Blaustein,1999）.以硝酸盐类化肥为例，当浓度在100mg·L-1时即可导致欧洲蟾蜍（Bufo bufo）蝌蚪17%的畸形率，并呈现出随浓度升高，畸形率升高的趋势（Xu and Oldham,1997）.畸形的类型有：蝌蚪头、胸部发育不对称、眼睛畸形、腹部水肿透明、尾部有水肿的瘤泡出现及勾尾等现象（Hecnar,1995）.蝌蚪正常情况下，可以维持自身的渗透压，但在化肥溶液中浸浴后，由于化肥的离子作用，破坏了蝌蚪正常的调节功能，失去了维护体内正常渗透压能力.而由于化肥对蝌蚪的损伤作用是一个由表及里的过程，因此，随着染毒时间的延长，化肥对蝌蚪的作用势必会深入至蝌蚪生理功能的调节方面，既影响到各种分泌腺的功能，甚至殃及蝌蚪的免疫调节方面.

以化肥的降解副产物——高氯酸盐处理南方豹蛙（Rana sphenocephala）蝌蚪，用硝酸钾化肥浸染美洲林蛙（Rana sylvatica）蝌蚪均发现其变态发育时间延长，甚至有很大比例不能完成变态发育过程而死亡（Ortiz-Santaliestra and Sparling,2007;Greulich and Pflugmacher,2003;Geiffis-Kyle,2005）.组织学观察发现蝌蚪的甲状腺腺泡体积明显缩小，进而表现出对甲状腺激素分泌的抑制（Ortiz-SantaliestraandSparling,2007;Greulichand Pflugmacher,2003;Geiffis-Kyle,2005）.有实验指出硝酸盐化肥染毒3周后，蝌蚪体内白细胞的数量和血红蛋白的含量均明显降低，即蝌蚪的免疫系统在化肥的作用下，也表现出了一定程度的损伤（Rouse et al.,1999;Dappen,1983）.

2.2.4 对组织结构及遗传物质的影响

有关化肥对蝌蚪组织结构和遗传物质的影响尚鲜有报道.本实验室初步观察发现，氮肥磷酸二铵可对花背蟾蜍（Bufo raddei.）肝脏组织造成明显的损伤，其显微及超微结构变化表现在：肝细胞呈明显的脂肪变性，出现由于淋巴细胞浸润形成的斑块状坏死区域，核内异染色质浓缩，粗面内质网扩张，部分细胞内出现髓样结构，且血窦内的淋巴细胞、巨噬细胞和枯否细胞逐渐增多；肝细胞糖原含量随磷酸二铵作用时间延长而降低，随化肥浓度升高而增多；蛋白含量和乳酸脱氢酶活性随染毒浓度升高和时间延长有增加的趋势；肝细胞内不同类型的抗氧化酶活性虽然变化有所不同，但酶活性变化均有明显的剂量-效应和时间-效应.此外，还发现磷酸二铵对蝌蚪也具有遗传毒性，可诱导蝌蚪红细胞微核及核异常的产生，并且红细胞微核率、核异常率与浓度、染毒时间呈现明显的相关性；从实验结果看，低于大田施肥量的磷酸二铵，已经构成了对蝌蚪组织结构和遗传物质的毒性效应（王锐等，2009）.

3 结语

近几十年来，全球范围内的两栖类动物出现了较快的种群数量下降，其中一些物种已经灭绝.由于两栖类个体发育的特殊性，其对生境的岛屿化、水质的污染、疾病、人为过度捕捉等多种因素表现出高度的敏感性（于凤兰和陆宇燕，2006）.农药与化肥的不合理使用所引起的水体污染是造成这一现象的重要原因.

农药可对无尾两栖类蝌蚪的影响目前研究较为深入，其对蝌蚪活动行为、胚后发育、组织结构、抗氧化系统、遗传物质等造成的损伤已有充分的实验依据，但是还有一些问题值得进一步探讨：1）蝌蚪通过体内哪些途径对农药的毒性产生抗性或适应性，从而在低毒农药染毒下死亡率维持在较低水平？2）关于农药对蝌蚪组织器官的损伤研究较少，其中各器官组织产生功能损害的机制是否与细胞凋亡有关？3）农药的神经毒性是否只与抑制乙酰胆碱酯酶活性有关？对于神经冲动的传入和传出过程是否也会有影响？4）农药对蝌蚪生殖系统发育的影响有哪些具体途径参与，目前国内外缺乏此部分研究.5）农药对蝌蚪内分泌和免疫系统的毒性研究相对不足.

与农药相比，国内外关于化肥对无尾两栖类蝌蚪影响的研究相对较少，对化肥对蝌蚪的毒性研究主要集中在存活率、孵化率及畸形率变化等宏观方面，对微观方面的研究相对贫乏.建议进一步的研究可从如下几方面进行：1）从分子（基因、蛋白）、细胞、器官和整体水平上，综合探讨化肥对蝌蚪产生损害的机制与规律.2）化肥污染是否会引起蝌蚪个体生殖系统的损伤，进而影响其正常的繁殖，最终导致种群的衰减，还有待于证实.3）确定蝌蚪体内对化肥污染较敏感的生物指标，将会为化肥污染的监测提供极大的帮助.4）关于化肥对蝌蚪遗传物质的影响尚需进一步研究.

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Research Advances in Toxicological Effects of Pesticide and Fertilizer Pollutants on the Anuran Larvae

LI Zhen1，LI Pi-peng1，XU Qi-yan2，LU Yu-yan1，*

1.Center for China Herp-Breeding and Conservation Research,Key Laboratory of Evolution and Biodiversity in Liaoning,Shenyang Normal University,Shenyang 110034
2.Liaoning Cancer Hospital&Institute,Shenyang 110042

The amphibian is considered as a suitable animal model to determine the toxicity of polluted environmental and to monitor the environmental health.The embryonic development and metamorphosis of amphibians are highly dependent on the water,and the gill and skin are highly permeable.When exposed to pollutants,amphibians can be changed obviously on the level of the molecule expression,cellular and tissue structure,and physiology.The pollutants may affect the survival and growth of amphibians.In this paper,it was summarized and reviewed that the toxic effect of pesticides and fertilizers on the behavior,growth and development,structural,physiological and biochemical changes of amphibian larvae,in order to provide a comprehensive scientific basis for monitoring the environment of water and logical rational use of agricultural compounds.

tadpole；fertilizer；pesticides；environmental monitoring

12 October 2009accepted1 December 2009

1673-5897（2010）2-287-08

X171.5

A

2009-10-12录用日期：2009-12-01

国家自然科学基金项目（No.30470206；No.30870276）；辽宁省优秀人才支持计划和省高校科研计划项目

李贞（1984—），女，硕士研究生；*通讯作者（Corresponding author），E-mail:luyuyan2001@yahoo.com

陆宇燕（1962─），女，教授，研究方向：细胞生物学；两栖爬行动物生物学及其保护与繁育.