酶抑制-比色法在农药残留快速检测中的研究进展

杜美红，孙永军，汪 雨，陈舜琮

(北京市理化分析测试中心，北京 100089)

酶抑制-比色法在农药残留快速检测中的研究进展

杜美红，孙永军，汪 雨，陈舜琮

(北京市理化分析测试中心，北京 100089)

概述酶抑制-比色法在农药残留快速检测中的检测原理、对不同种酶源的选择与保存、酶抑制法检测条件及改进方法等研究进展，并指出酶抑制-比色法在使用中存在的问题和未来的发展趋势。

酶抑制法；农药残留；快速检测；比色法；有机磷类；氨基甲酸酯类

蔬菜中的农药残留问题近年来成为舆论焦点，同时也引起了政府的关注[1-3]。但是蔬菜是种特殊的农产品，其保鲜时期很短，流通环节不宜过长，如果用常规的检测方法，没等检测完毕，蔬菜就已经失去了食用价值。另外，这类农产品农药残留问题较多、较严重，易引发急性中毒事件，因此用于检测蔬菜、水果中的有机磷、氨基甲酸酯类农药的酶抑制法快速检测技术备受重视[4-6]。

1 酶抑制法检测原理

酶抑制法是研究最多且相对成熟的一种对部分农药残留进行快速检测的技术[7-9]。我国已将其列入国家标准GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》中作为农产品中农药残留的快速检测方法。该法测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留具有快速、简便、灵敏及成本低等优点，深受广大基层监督部门、生产基地及市场的欢迎[10-11]。

其主要原理是在一定的条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶催化水解的功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。利用这一特性，在酶反应实验中加入底物和显色剂观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可判断有机磷或氨基甲酸酯类农药是否残留。这种利用酶抑制产生显色反应，通过分光光度计比色测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的方法称为比色法。

2 不同种酶源的选择与保存

酶源选择是酶抑制法应用的基础，其性质好坏、特异性大小、稳定性强弱直接关系检测结果。不同种类、不同来源的酶源，对检测灵敏度的影响有较大差异。检测技术中应用的酶，既有来源于动物的也有来源于植物的，并且所提取的方法也不相同。

2.1 动物酶源

动物酶源应用广泛，由于方法本身对酶纯度要求不太高，因此，一般方法提取的酶液便可满足需要[12-13]。王小瑜等[14]以商品乙酰胆碱酯酶(来自家蝇)和自制的鸡肝乙酰胆碱酯酶(AChE)、鲤鱼脑AChE为研究对象，比较3种不同浓度的有机磷农药(氧化乐果、敌百虫和敌敌

畏)对这3种酶的酶活力抑制率。结果表明，3种农药对家蝇AChE的抑制率最高；对鸡肝和鲤鱼脑AChE的抑制率比家蝇AChE低；3种AChE对氧乐果都不敏感。张慧君等[15]以商品AChE和自制鸡肝酶为农药检测用酶，比较了不同浓度的敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷和西维因对这两种酶的抑制情况。结果表明，鸡肝酶的AChE酶活力较低，而其总酯酶活力对4种农药的灵敏度与商品AChE活力的灵敏度相近，且总酯酶活力对除马拉硫磷外的其余3种农药的检出限都较AChE低。同时对总酯酶活力测定的pH值进行了优化，发现pH6.5时总酯酶活力较高。王学贵等[16]运用酶抑制-比色法，以菜青虫AChE作为实验酶源，测定了四川雅安地区的四季豆、生菜、凤尾等5种蔬菜中氧化乐果的残留量。Valdés-Ramirez等[17]选用电鳗电器官、基因重组果蝇(B394)及野生果蝇提取的AChE分别进行灵敏度比较实验，结果发现基因重组果蝇(B394)所提取的AChE 检测敌敌畏的检测限为7×10-11mol，野生果蝇所提取的AChE检测限为1× 10-8mol，电鳗电器官所提取的AChE检测限为6×10-6mol。余孝颖[18]用酶电极法研究了有机磷农药对3种不同生物来源的AChE的选择性抑制，发现敌敌畏对家蝇的AChE抑制最强，电鳐AChE次之，鸡肝AChE阳性弱反应，同时研究了5种农药对电鳐AChE的选择性抑制能力，发现9.8×10-8mol/L辛硫磷即可抑制其活性的10%。

2.2 植物酶源

植物酯酶检测农药残留可以达到与动物胆碱酯酶相当的准确度和精密度。植物酯酶酶源丰富，取材方便，在农药残留快速检测中应用前景更加广阔。李治祥等[19]应用植物酯酶的抑制技术，测定蔬菜水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的简易薄层-植物酶抑制(TLC-EI)法。该法对多种农药的最小检出量为纳克级，最小检出质量浓度为0.01mg/L，添加回收率在80%以上。黄志勇等[20]在通过正交试验优化胆碱酯酶与植物酯酶的测定条件下，比较对蔬菜中有机磷农药残留的测定，其加标回收率都在85%以上。但植物酯酶法测定结果较好，精密度为3%。林素英等[21]研究了各种不同豆类来源酯酶对有机磷农药的敏感性得出绿豆、黑豆来源酯酶的总酯酶活力和敏感性最好。朱霞萍等[22]基于α-乙酸萘酯和固蓝B在面粉酶的催化作用下生成紫红色的偶氮化合物，而有机磷农药在双氧水的活化下会抑制酶的催化作用，其抑制程度与农药的浓度在一定范围内呈线性关系，由此建立了一种快速测定有机磷农药的方法。探讨了最佳的反应条件，测定甲基对硫磷和甲胺磷的线性范围分别为l～10μg/mL和l～50μg/mL，最低检出限分别为0.1136、0.3525μg/mL。温艳霞等[23]证实有机磷农药残留检测最佳的植物酯酶来源为黄豆种子，不仅总酯酶含量高而且对敌敌畏、对硫磷、久效磷等几种农药残留最低检测限可达到我国或欧盟规定的最低允许残留量标准的要求。穆随选等[24]通过对6种木本植物的总酯酶活力、比活力、农药敏感性和最低检测限的测定，得出国槐的总酯酶活力是小麦的1.53倍，刺槐总酯酶活力是小麦的2.036倍，比活力是小麦的1.17倍，而侧柏、洒金柏、杜仲和腊梅酯酶总活力和比活力均低于小麦，实验表明刺槐为适宜的植物酶源。康天放等[25]为了快速检测蔬菜中的有机磷农药残留状况，分别从京9428、京9583、京东8A、京2小麦中提取植物酯酶，将这些酶用于有机磷农药的检测，采用分光光度法比较了不同质量浓度对硫磷对小麦酯酶活力的抑制情况：结果表明，不同品种小麦酯酶对于对硫磷的敏感度不同，在所研究的小麦酯酶中，京2酯酶对对硫磷最为敏感，其检测限达到3.0×10-7mg/L。于基成等[26]利用酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留，以小麦为对照，比较了大豆、玉米、绿豆等10种植物中植物酯酶活性，优化了植物酯酶提取条件。同时系统地研究了酶促反应条件，建立了酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法。研究结果表明，以绿豆中提取的粗酶酶活力最高，提取条件为：以0.1mol/L pH值为6.2的磷酸缓冲液为提取剂，按固液比1:5(m/V)加料，在40℃搅拌20min，过滤。最佳酶促反应条件为：反应体系0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液、反应时间15min、反应温度40℃、显色时间10min、测定波长520nm处吸收峰值；样品提取用含10%乙醇的0.1mol/L pH6.4的磷酸缓冲液超声波振荡10min；方法的回收率为86.7%～97.1%，最小检出限为0.13～0.24 μg/mL。钱立立等[27]用电动流动分析和酶抑制法测定池塘水中有机磷和氨基甲酸酯农药残留折合总量。酶抑制法用面粉酯酶，有机磷和氨基甲酸酯农药作酶抑制剂，底物的酶解产物与显色剂反应，用分光光度计在波长524nm处检测。有机磷和氨基甲酸酯农药的折合浓度对数线性范围为0.02～0.20mg/L氧化乐果，检出限为0.01mg/L氧化乐果，每小时可测24个样品。氨基甲酸酯在80℃完全水解，而有机磷部分水解，据此可判断农药类别。

2.3 微生物酶源

在一些文献中也有采用微生物作为酶源的，如Walz等[28]从镰刀菌pisi中提取角质酶，利用酶抑制分光光度法和96孔板法同时检测多个样品中有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的含量，该法对毒死蜱和对氧磷的检测限分别为2.6mg/L和0.04mg/L。

2.4 保存及稳定性

目前，国内市场上农药残留检测酶试剂主要有冻干工艺生产的固态酶和传统工艺生产的液态酶两种，为了提升保存的质量不少研究人员对其保存条件及保护剂做

了大量研究。周艳利等[29]对大豆酶稳定性的研究得出在4℃保存30d，酶活力损失较少；在－20℃保存30d，完全失活；在50℃以下，pH值在6.0～9.0保存10min，酶活力无明显变化；保护效果好的保护剂依次为牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖和甘油。周艳明等[30]利用冷冻干燥方法并在干燥过程中加入5%的聚乙二醇可以有效的保护酶制剂不失活，植物酶干粉在室温下保持一个月以后仍能表现出良好的稳定性。蔡琪等[31]通过添加2%正丁醇、5%蔗糖、1%动物血清白蛋白及自制高效保护剂，在保持所研制的农药残留检测胆碱酯酶高检测灵敏度的前提下，使该液态酶试剂的保存性得到很大提高，冷藏条件下可长期保存，室温保存15d酶活性无明显下降，37℃高温条件下放置2周仍能保持60%以上的酶活性。

3 酶抑制法检测条件

酶是一种生物催化剂，其反应速度受温度、pH值、环境中离子、酶抑制剂等因素影响，一方面应尽量避免环境因素的影响，另一方面也要开发改良反应体系。

3.1 酶反应最佳条件

影响测定误差大小的因素很多，诸如酶和底物来源及浓度，反应温度、pH值和反应时间等，因此其重现性不佳。李顺等[32]通过正交试验和极差分析得出酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的最佳检测条件为：抑制时间15min、抑制温度35℃、底物加入量100μL、酶液加入量100μL。董杰等[33]对利用家蝇头部AChE检测有机磷残留量探索了最佳条件，其研究结果表明：家蝇初羽化至羽化后第15天，其头部AChE的酶活力逐渐升高((0.4483±0.0104)～(0.7769±0.0189)μmol/(mg·min))，而酶源蛋白质的含量逐渐下降((187.0222±9.0213)～(83.0222±7.1111)μg/头)。羽化后2～4d，其头部AChE的敏感度最高；初羽化和羽化后第15天，敌敌畏的IC50分别是羽化后第3天的1.4倍和2.1倍。在一定的pH值范围内(6.6～8.0)，家蝇头部AChE的酶活力随缓冲液pH值的升高而增大。王文祥等[34]研究了磷酸缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物、酶用量对兔血清AChE活力测定的影响，结果表明，供试AChE活力最佳条件是：磷酸缓冲液(pH8.0)3.0mL、显色剂0.6%二硫双对硝基苯甲酸(DTNB) 50μL、0.75%酶液(pH8.0)100μL、反应温度35℃。混匀稳定后加入底物l%碘化硫代乙酰胆碱(BTCI)50μL。反应l80s后在波长412nm处测定光密度。在上述条件下，测定结果表明有机磷杀虫剂丙硫磷(prothiofos)质量浓度在0.0125～0.4g/mL，保育时间5～30min与AChE抑制率之间存在良好的相关性，可根据检测需要调整保育抑制时问。杨东鹏等[35]提出了新的最适条件确定标准，即保证酶的活性保持在一定水平的基础上(0.1333min-1≤k1≤2667min-1)，选择抑制率(以甲胺磷为抑制剂)最高时的温度和pH值作为最适条件。确定了抑制时间为10min时的最适条件为：抑制温度47.0℃，pH7.7。进而在此最适条件下确定了新的检测结果判断标准：当酶抑制率≥58%时，蔬菜中含有某种有机磷或氨基甲酸酯类农药残留为阳性。裘正军等[36]通过单因素对比试验研究了吸光度随反应时间的变化关系、温度对酶活性的影响及农药残留浓度与酶抑制率的关系。结果表明吸光度随反应时间逐渐增加，反应前期增速快，线性度好，适合测量；酶在20～40℃时具有最佳的活性，灵敏度高；农药残留对酶的抑制作用明显，当抑制率高于70%时可判定农药残留超标。张叔平等[37]为快速检测农药残留，建立了一种快速检测方法——酶抑制率法，确立了最优化条件，得出了普遍公式，根据我国国家标准允许残留限量可知其对应的抑制率阈值。

3.2 酶反应体系及底物

酶抑制剂显色反应可使用的底物和显色剂很多，不同的酶与底物配合使用，其检测限不尽相同。刘文君等[38]对酶抑制法常用的底物2,6-二氯靛酚乙酸酯和固兰B盐进行比较实验，结果表明：2,6-二氯靛酚乙酸酯较固兰B盐更优越，更适合于有机磷农药的快速现场检测。2,6-二氯靛酚乙酸酯作为底物的优越性主要表现在：与生成物有良好的稳定性；植物酯酶的反应条件较为协调合理；敌敌畏对植物酯酶的抑制率与农药浓度对数值呈良好的线性关系；用添加农药法测定的回收率较高。侯学文等[39]利用胆碱酯酶水解碘化酰胆碱后形成的硫代胆碱，与二硫双对硝基苯甲酸发生化学反应生成黄色产物，在波长412nm处比色测定。利用此法测定酶、底物的添加量以及保温温度和保温时间对酶活力的影响，还研究了不同浓度与保温时间的辛硫磷对胆碱酯酶活力的抑制情况。获得了胆碱酯酶优化的反应条件，结果表明胆碱酯酶对辛硫磷比较敏感。周和喜[40]利用速测卡中的胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸与靛酚(蓝色)。而有机磷或氨基甲酸酯类农药则对胆碱酯酶有抑制作用的特点，通过颜色变化，判断样品中是否存在高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药。刘伟[41]采用高灵敏度的乙酰胆碱酯酶-硫代黄素T体系作为识别元素，在此体系中加入有机磷农药后，AChE -硫代黄素T体系特征荧光峰发射峰(波长490nm)被猝灭，荧光猝灭强度与农药浓度存在线性关系，因此可以直接确定农药浓度。宛梅丹等[42]建立乙酸靛酚酯-丁酰胆碱酯酶法农药残留快速检测反应体系比传统的胆碱酯酶-碘化硫代乙酰胆碱法测定步骤更简便，保温所需时间更短。刘畅等[43]以二次盐析后的鸭血清丁酰胆碱酯酶(BchE)为农药残留的检测用酶，碘化硫代丁酰胆碱(BTChI)为底物，5-5'-二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，410nm波

长处比色测定吸光度变化，计算胆碱酯酶的抑制率，从而推算农药残留情况。当抑制率大于35%时，表明农药含量超标。检测过程只需20～40min，并可同时检测多个样品。

4 其他改进方法

4.1 增敏

在生物体外，有许多农药是酶的弱抑制剂，因此需要使用适当的转化剂，使其变成酶的强抑制剂。赵永福等[44]采用植物酯酶抑制法测定了蔬菜中农药的残留，研究了阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠对显色体系的作用。结果表明，十二烷基硫酸钠具有显著的增敏效果，其增敏幅度达到70%，同时对显色剂有增稳作用。用所建立的方法测定蔬菜中残留的敌敌畏，线性范围为0.11～1.6mg/L，最低检出限0.04mg/L。

4.2 前处理

除了有机磷和氨基甲酸酯类物质有可能对酶产生抑制作用外，食用植物中某些氯代烟碱类似物质对AChE也有一些抑制作用，因此检测过程可能出现假阳性。桑园园等[45]选用实际检测中易出现假阳性现象的韭菜、蒜苗、蒜黄、大蒜4种蔬菜为材料，利用酶抑制法检测农药残留，并对样品前处理步骤进行改进，增加了对样品提取液加热处理，达到消除假阳性的目的。结果表明，对样品提取液进行适当加热可以起到消除假阳性的作用，且不会造成残留农药的损失。蒜苗、蒜黄、大蒜、洋葱的最佳处理温度分别为110、100、120、80℃，在达到相应最佳消除温度后，假阳性影响消失，且加热时间对假阳性影响不显著。王琳玲等[46]研究了萃取技术对酶抑制效果的影响，结果表明，利用亚临界水萃取技术在萃取温度70℃，萃取时间5min，提取液pH8.0，提取液体积为5mL的条件下，灭多威有最高萃取效率。黄永春等[47]对现存农药快速检测技术中提取效率问题进行研究，当添加农药后的时间间隔为2h时，添加的农药主要以简单吸附持留在蔬菜表面，80%～98%的添加农药可以被提取出来，随着时间间隔的延长(至5h)，采用表面冲洗的农药提取效率急剧下降，大部分农药的提取效率为20%～60%，简单表面冲洗法在实际应用中很难将蔬菜中残留的农药提取出来。冯国栋等[48]开发出一种用于大米、面粉、水果、蔬菜等样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的现场快速前处理方法和化学试剂盒。并且讨论了影响现场快速检测的主要因素，对大多数有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出下限可达0.1～3.0mg/kg。王琦[49]在不同条件下分别处理油菜、甘蓝、苹果上的甲胺磷和氧化乐果农药残留，确定了不同处理剂的去农药残留效果和较佳处理条件。与此同时，测定不同处理剂在不同处理条件下对油菜、甘蓝、苹果营养品质的影响，以最终确定最佳处理条件。钟树明等[50]应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的有机磷及氨基甲酸酯类农药。用小柱对样品进行预处理，可去除叶绿素的干扰、提高检测灵敏度。提出了抑制率阈值(15%)。应用此方法对市售蔬菜的农药残留进行调查，检出率约为10%。

5 问题与展望

综上所述，尽管酶抑制-比色法在快速检测农药残留中有广泛应用，但它仍然存在一些问题。由于酶结构的复杂性和多样性，即使同样酶源的酶在不同生产批次对同种农药也会出现一定差异，而且同一批次的酶对不同种农药的灵敏度也有很大差异，所以容易出现假阳性或假阴性。由于比色法检测以吸光度变化计算相应酶的抑制率，植物体的内容物如氧化酶次生物质叶绿素、花青素等必然会对酶反应产生干扰，检测液的颜色会有变化，导致检测结果专一性、准确率、可比性等都存在问题。

农药残留快速检测是一件严肃认真的工作，不仅需要可靠的仪器及方法更需要规范的操作和健全的制度。随着各类技术纵向的发展与横向的联用，农药残留快速检测中的瓶颈问题势必会得到解决。

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Advances in the Application of Enzyme Inhibition/Colorimetric Assay to the Rapid Detection of Pesticide Residues

DU Mei-hong，SUN Yong-jun，WANG Yu，CHEN Shun-cong
(Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

This paper summarizes the principles of enzyme inhibition/colorimetric assay, sources and preservation of enzymes used in the assay and enzymatic reaction conditions. In addition, the problems encountered during its application and the future development trends are pointed out.

enzyme inhibition；pesticide residues；rapid detection；colorimetry；organophosphoms；carbamates

TS207.3

A

1002-6630(2010)17-0462-05

2010-06-29

国家科技部专项“科学仪器设备质量评价体系构建”项目(2009IM033200)

杜美红(1974—)，女，助理研究员，博士，研究方向为食品安全分析检测。E-mail：dumeihong@hotmail.com