RASSF1B基因的克隆及序列分析

陈吉祥,陈明军,张尤历

(江苏大学附属医院,江苏镇江 212001)

近年来的研究发现,人染色体 3p21.3等位缺失与多种肿瘤的发生有关[1],该位点存在肿瘤抑制基因 RASSF1基因家族[2,3]。该家族至少包含 7种不同的转录本(转录本A～G)。RASSF1B基因在肿瘤组织和正常组织中都有表达,但其功能尚没有明确[4]。本研究采用 RT-PCR结合生物信息学方法对胃癌、肝癌等肿瘤细胞中的 RASSF1B基因进行了克隆及序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料 5株肿瘤细胞分别为胃腺癌细胞 AGS、肝癌细胞 HEPG2、高转移肺癌细胞 95D、肺腺癌细胞LTEP-a-2、白血病细胞U937。MMLV反转录试剂盒等。

1.2 细胞培养 将上述 5种肿瘤细胞分别加DMEM及 10%小牛血清,置 CO2培养箱中 37℃培养至细胞均匀覆盖细胞瓶约 3/4。

1.3 RNA的提取、扩增及克隆 以 Trizol提取上述各种细胞的总RNA并纯化,用MMLV反转录得到cDNA。利用DNAstar软件设计 RASSF1B基因的特异引物,扩增引物为 5′-ATG AGC TTG AAC AAG GAC GG-3′(上游引物)、5′-TCC ACC TGG GGG TAC AAGAGG-3′(下游引物),扩增长度为 591 bp。以人β-actin作内参照,引物序列为 5′-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3′(上游引物)、5′-GGC GTA CAG GTC TTT GCG GAT G-3′(下游引物),扩增长度为 512 bp。PCR反应条件:95℃、2 min,94℃、15 s,58℃、30 s,72℃、1.5 min,30个循环,72℃、10 min。以1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。将RASSF1B的 PCR产物连接到 T-载体上,转化到大肠杆菌DH5α中,经蓝白斑筛选出阳性克隆。

1.4 RASSF1B基因的序列分析 应用生物信息学软件分析。

2 结果

分别提取了 5株肿瘤细胞的总 RNA。凝胶电泳结果显示,28 S和 18 S条带较为明显,RNA的完整性和质量较好。核酸检测仪检测显示A260/A280均在 1.9～2.0,与电泳结果一致。

经RT-PCR扩增后,RASSF1B在 5种肿瘤细胞中均有表达,其中在肺腺癌细胞株LTEP-a-2和白血病细胞株 U937中的表达量较高,在其他三种肿瘤细胞中的表达量较少。肺腺癌细胞株LTEP-a-2、白血病细胞株U937、胃腺癌细胞株 AGS、高转移肺癌细胞株 95 D、肝癌细胞株 HEPG2的 RASSF1B mRNA相对表达量分别为 0.62、0.71、0.07、0.22、0.13。

将RASSF1B的 PCR产物连接到 T-载体上,转化到大肠杆菌DH5α中,经蓝白斑筛选出阳性克隆。测序结果表明克隆后的基因全长为 591 bp,其中编码区为 570 bp,编码 189个氨基酸,与网上登录RASSF1B一致 (Genbank序列号:NM_170712)。应用生物学软件 ExPASy Proteomics Server对其进行分析,结果显示,RASSF1B基因含有一个 Ras结合区域(45～139 aa)和一个 SARAH区域 (143～189 aa)。

3 讨论

RASSF1家族是近年来发现的,目前的研究表明,其不同的转录剪切本在恶性肿瘤的发生和诱导细胞凋亡过程中发挥重要作用,它们能够直接参与细胞周期的调控。但其作用机理尚未明确。

有研究表明,在一些基因家族中,各转录本之间存在协调表达,一旦表达平衡被打破,就会导致细胞不正常增殖[5]。因此,在不同的细胞系中分析各转录本表达比例的变化可以初步推断各转录本与肿瘤发生间的关系。由于RASSF1家族的转录本A在正常和癌变的组织中表达差异明显,故研究较多。其转录本B在肿瘤组织和正常组织中表达差异不大,被普遍认为是没有特殊生物学功能的基因,一直没有受到重视。本研究采用 RT-PCR方法,在 5种肿瘤细胞中扩增出 RASSF1基因,进行测序验证,发现在不同的癌变细胞系中,RASSF1B虽都有表达,但表达量存在明显的差异,在肺癌细胞系及白血病细胞系中表达量高。而在这几种肿瘤细胞系中并未明显地扩增出转录本 A的片段,提示 RASSF1B的表达量可能与肿瘤的类型有关,其在不同种类的癌变细胞中所起的作用可能不同。

生物信息学分析发现,RASSF1B含有一个 Ras结合区域和一个 SARAH区域。Ras区域是该家族共有的区域。Ras通路是所有细胞都具有的一条高度保守的信号传递通路。Ras蛋白在有活性的 GTP结合构象和无活性的 GDP结合构象之间转化,与不同的效应物分子激活多条信号传递通路。有文献[6]报道,RASSF1B是通过 Ras区域以 GTP方式直接与Ha-Ras相结合。SARAH区域可以调节细胞信号转导[7]。活化的Ras蛋白具有促进细胞生长增殖的作用,RASSF1B基因可能通过 GTP方式直接与Ha-Ras相结合,通过抑制 Ras的激活途径而抑制细胞生长、促进细胞凋亡;RASSF1B能通过阻断 Cyclin D1的积累及细胞周期 G1/S期的进展而抑制肿瘤生长[8]。需进一步通过 RNA干扰等方法,抑制RASSF1B基因的表达,然后分析细胞的生长状态,以明确该基因与细胞增殖间的关系。

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