猪瘟诊断方法的研究进展

叶 芬，蔡家利

（1.西南大学动物科技学院，重庆 400700；2.重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆 400050）

1 猪瘟病毒的分类、形态与结构

猪瘟隶属于黄病毒科、瘟病毒属成员，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，粒子直径为34～50nm，从电镜照片观察，可见病毒粒子表面有脆弱的纤突结构，病毒核衣壳呈二十面体对称，内部核心直径约为30nm。病毒在蔗糖密度梯度中的浮密度是1.15～1.16g/cm3，等电点是4.8。在脂蛋白囊膜上，存在着病毒基因组编码的囊膜糖蛋白E0（也被称为ERMS）、E1和E2，组成核衣壳蛋白的C蛋白与病毒基因组相连，以维持核酸的稳定性。

2 猪瘟诊断方法研究进展

2.1 猪瘟实验室常规诊断技术

2.1.1 免疫荧光试验 免疫荧光试验（FAT）是猪瘟的常用诊断方法。猪瘟荧光抗体染色技术是将提纯后的抗CSFV抗体IgG标记上荧光物质，制成猪瘟荧光抗体染色试剂。用该试剂去着染猪病料（如病猪扁桃体、淋巴结、肾等）的冰冻切片或触片，然后利用荧光显微镜观察组织细胞内是否有亮绿色荧光。如果被观察的组织细胞内有亮绿色荧光，就是猪瘟病毒荧光抗体染色阳性，说明被检病料中有CSFV感染。反之，被观察的组织细胞内没有亮绿色荧光，就是猪瘟病毒抗体染色阴性。

利用荧光抗体技术检测病猪内脏器官可能存在的CSFV，对CSF的早期诊断具有十分重要的意义。猪瘟荧光抗体染色技术在CSFV感染早期检出率较高，不仅能检出强毒抗原，还能检出低毒力病毒感染的带毒母猪，猪瘟的常规诊断需要4～5 d，而该项技术可在12h内作出判断，既快速又客观、准确，在规模化猪场临床上得到了广泛应用。所以目前许多规模化大猪场利用荧光抗体染色技术，有计划地对猪场进行猪瘟净化。

Robert son等首次将FA运用于猪瘟病料和组织培养物的检测。张淑霞等从抗猪瘟高免血清中提取IgG，标记荧光素（FITC），制备出了猪瘟荧光抗体（CSFV-FA）。该抗体能够检测人工感染猪扁桃体中的病毒抗原，而且这种荧光反应能够被抗CSF高免血清特异性抑制。应用CSFV-FA可在病死猪的扁桃体、脾、肾、回肠末端等器官的触片或冰冻组织切片中发现病毒抗原，也可先将可疑病料经无菌处理后接种于细胞培养物，随后再用CSFV-FA检测出感染细胞中的猪瘟病毒抗原。FAT法简单、快速、可靠，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定诊断试验。

2.1.2 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验（ELISA）具有高度敏感性和特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断发展，酶联免疫测定的技术方法也得到发展和更新，Dot-ELISA、发光酶联免疫测定、免疫印迹法、BAS-酶联免疫吸附试验等方法都不断得到应用。

周宗元等应用猪瘟兔化弱毒PEG沉淀抗原和HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA检测CSFV抗体的方法，通过对5份阴性血清和32头仔猪注射疫苗前后不同时期的256份血清进行检测，证明本法有较高的敏感性和特异性。余兴龙等以在大肠杆菌中高效表达的CSFV的E2基因产物为抗原，以HRP标记的的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测CSFV抗体的间接ELISA方法，结果表明用E2基因产物蛋白作为诊断猪瘟的抗原，具有特异性高、易纯化和成本低等特点。陆芹章等（2004）制备了猪瘟单克隆抗体，以ACI-ELISA法检测CSFV，并用PCR方法作比较，结果表明30份猪瘟阴、阳性病料的ACI-ELISA试验结果与PCR检测结果相符，本方法与动物接种、免疫荧光、血清中和等CSF常规诊断方法比较，更加快速、准确、经济，且一次可检测大量样品，同时比PCR方法耗时短、费用低，便于推广。陈振海（2005）等以CSFV GST-Erns融合蛋白作抗原进行间接ELISA，结果表明用该方法检测CSFV抗体具有很高的特异性和敏感性。

目前，已有很多采用基于中和性单抗的竞争ELISA方法来检测某些病原中和抗体的报道，说明利用CSFV中和性单抗作为竞争抗体检测CSFV中和抗体是可行的。梁冰冰等利用杆状病毒表达猪瘟病毒（CSFV），以重组E2蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的E2蛋白中和性单克隆抗体作为竞争抗体，建立了一种用于检测CSFV中和抗体的重组E2蛋白竞争抑制ELISA（CI-ELISA）方法，该法操作简便、快速，适于现场应用，同时具有一般ELISA的操作优点，可以用于大量现场样品的检测和流行病学监测。

2.2 分子生物学诊断方法

2.2.1 常规反转录-聚合酶链反应 聚合酶链反应（PCR）技术的建立带动了分子生物学的飞速发展，应用反转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）成功测定了多株CSFV的全基因序列，为猪瘟的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。因为在临床检测中要经常检测RNA病毒，而通常所用的PCR试剂盒是DNA聚合酶，不能以RNA为模板直接扩增，故在进行PCR前，先将病毒RNA逆转录为 cDNA，所以建立了RT-PCR技术。随着人们对CSFV分子生物学研究的深入，尤其是对CSFV Alfort株和 Bresica株基因组全序列的成功测定，使得RT-PCR技术在CSFV的研究中被广泛应用。RT-PCR作为检测CSFV的一种方法，其特异性强、灵敏度高、重复性好，操作也很简单，整个过程在1 d内即可完成，能达到快速检测的目的，并且适合于各种含毒材料的检测，也可用于临床。此外，RT-PCR技术还可区别与CSFV相关的病毒，如BVDV，以及能引起和CSF相似临床症状的猪病病毒，如亚洲CSFV、伪狂犬病病毒，其灵敏度可达100%。

2.2.2 实时荧光定量PCR技术 荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术，因其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为核酸检测中的重要工具。它是在常规PCR引物之外加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。该技术的研究也逐渐成为猪瘟诊断方法研究的方向。由于实时定量荧光PCR仪可以同时检测多种荧光，因此可以进行多重检测，即在同一个反应体系中，将不同探针标记上不同的荧光基团，这样就可以同时检测多种疾病的病原，这也是疫病诊断的一个研究方向。Risatti等（2003，2005）建立了一种实时荧光定量RT-PCR方法检测CSFV，并与病毒分离作了比较，证明其敏感性高于病毒分离（100%/72.4%），特异性略低于病毒分离（98.9%/100%）。日本学者Ophuis等（2006）应用荧光定量RTPCR方法对攻毒猪各组织脏器中的病毒进行了检测，结果发现早在攻毒后1 d就在扁桃体中检测到了病毒的存在。Cho等应用不同荧光基团标记的两条TaqMan-MG探针建立了一种能鉴别韩国CSFV野毒株和LOM疫苗株的荧光RT-PCR方法。

2.2.3 核酸探针技术 核酸探针技术是在分子标记的基础上，以病毒RNA基因组为模板制备探针，在cDNA合成之后，进行Southern blot，特异的核酸探针会在不同病毒基因组cDNA上产生特异的条带。此方法具有特异性强、准确可靠的优点，但诊断费用较高。此法可用于不同毒株的分离和鉴定。Cruciere等、Dable等、Colijn等利用 CSFV基因组 RNA构建cDNA，与BVDV进行序列分析和比较，合成了6个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异的杂交条带可以区别CSFV、BVDV和BDV。我国赵启祖等研制了石门血毒P80核酸探针，可对病毒RNA进行定量检测，灵敏度达220 pg。核酸探针技术有特异性强、准确可靠的优点，但需要合成核酸探针，诊断费用较高。

2.2.4 基因芯片检测技术 基因芯片是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，在基因表达谱、功能基因组、疾病基因诊断等基础研究及临床应用中已经显示出重要的理论意义和广泛的应用前景。它被誉为又一次生命科学领域的革命，世界各国争相投入研究。

基因芯片是指在一个很小的表面，通常是硅化玻璃，覆盖上成千上万的寡核苷酸，每一个固定在芯片上的特定位置都可以找到这个点，每个寡核苷酸反应芯片上有成千上万的拷贝互补信息，包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片，主要目标是用于DNA序列的测定、病原检测、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。基因芯片技术为动物疾病诊断提供了新的技术理念，出现可以替代传统方法的新技术，并形成新产品。目前，我国也正在研究应用基因芯片检测技术来诊断猪瘟，这将对我国猪瘟的防控具有深远意义。

3 结语

我国现阶段CSF流行形势复杂，没有明显规律性，CSF仍是我国动物疫病防制的一大难题，防控任务艰巨。在目前已有的检测手段中，分子生物学方法高度灵敏特异，且检测迅速，十分适合大面积检测，有着不可替代的优势。分子标记疫苗一旦成熟，血清学方法就能够进行鉴别诊断，ELISA方法也具有广阔前景。基因芯片诊断技术是一种高效、灵敏和特异性好的诊断技术，在不久的将来将会广泛应用于猪瘟诊断。

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