鸡毒支原体病原学及疫苗的研究进展

王永明，刘娟，王晓丽，章刚

（山东滨州华宏生物制品有限责任公司，山东滨州 256600）

鸡毒支原体感染(MGI)，通常被称为鸡败血性霉形体感染或鸡慢性呼吸道病（CRD），在火鸡则成为传染性窦炎，临床上以呼吸道症状为主，特征表现为咳嗽、流鼻液、呼吸道音，严重时呼吸困难和张口呼吸。

该病发展缓慢且病程长，并常与其他病毒或细菌混合感染，剖检时可见鼻窦和气管有卡他性渗出物以及严重的气囊炎，感染此病幼鸡发育迟缓，饲料报酬率低，产蛋鸡产蛋下降，病原可在鸡群中长期存在和蔓延，并可通过蛋传播给下一代。

本病广泛分布世界各地，随着养鸡业集约化程度的提高，饲养方式的改变以及饲养密度的提高，在通风不良、空气中氨和灰尘增加或气温骤降等环境中，容易发生本病。其他诸如疫病混合感染，甚至接种鸡新城疫和传染性支气管炎等活疫苗后也可诱发本病，目前该病已成为集约化养鸡场的重要传染病，严重影响着养鸡业的健康发展。

一、病原学

本病的病原体为鸡毒支原体（MG）。其大小为250～500 nm,能通过450 nm的细菌滤器，形态不一，呈高度多形性，常见的有球状、丝状，还有杆状、环状、螺旋状等不规则形态。姬姆萨染色着色良好，革兰氏染色阴性，着色较淡。MG为需氧或兼性厌氧菌；在人工培养时对营养要求较高，需要在培养基中加入10%～15%的灭活猪或马血清、胰酶水解物和酵母浸出物才能生长。在固体培养基上，需置潮湿的环境中培养3～10 d才能形成表面光泽透明、边缘整齐、露滴样的小菌落，且菌落为“煎蛋样”。MG可吸附鸡、火鸡和仓鼠等动物的红细胞，这是与非致病性禽源支原体的主要区别。

MG能发酵葡萄糖和麦芽糖、产酸不产气、不发酵乳糖、卫茅醇或水杨甙、不水解精氨酸、可还原四氮唑（变红）和四唑蓝（变蓝），对毛地黄皂甙敏感。

MG对理化因素的抵抗力不强，对紫外线敏感，阳光直射便迅速丧失活力，一般常用的化学消毒剂均能迅速将其杀死；50℃约20 min即可将其灭活，在沸水中立刻死亡。液体培养物在4℃保存不超过1个月，在-30℃中可保存1～2年。MG对链霉素、四环素族、氯霉素、红霉素、泰乐菌素敏感，但也易产生耐药性。

二、鸡毒支原体的发病机理及免疫机制

（一）鸡毒支原体的致病力MG的致病力包括病原性和毒力两方面。其毒力的强弱因分离株的来源、传代方式、传代次数的不同而有差异。例如：MG弱毒株F株在液体培养基中连续传代36代后其对鸡的致病性减弱，有的菌株经75次、95次肉汤培养基传代后失去感染力。

MG的致病力与其本身的神经氨酸酶、过氧化氢或者其他溶血素、血卵磷脂酶、内毒素有关。这些酶或毒素引起细胞损伤或死亡，或使宿主细胞抗原性改变，近年来发现支原体的感染可引起自身免疫性反应。感染发生时，MG首先吸附到宿主细胞的表面，在禽的呼吸道内，气管上皮细胞通过膜上的唾液酸受体与MG结合，从而使纤毛运动受阻，细胞变性，最后脱落。被感染的细胞线粒体肿胀，细胞浆呈网状。并且，MG亦可在细胞的表面进行存活繁殖，鉴于MG的这一特性，有些学者建议将细菌、病毒等编码保护性抗原的基因克隆入弱毒支原体，用这种重组支原体做免疫接种，能够提高禽类对不同疾病的抵抗力，同时还可以降低免疫的次数，减少禽类对免疫的应激反应，而且不会影响免疫接种的效力。

从MG的表面结构看，细胞膜上有特殊的末端结构和黏附蛋白因子，MG可以借助细胞膜上特殊的末端结构牢固地吸附于宿主细胞表面，同时将其微管插入细胞内，将核酸、酶等物质注入宿主细胞，并将酶所分解的产物，如核苷酸及宿主细胞膜的脂肪酸、甾醇等吸入细胞内，以供菌体利用，从而影响宿主的糖代谢及分子合成。鸡毒支原体产生的毒素为神经毒素，能与细胞紧密结合；产生的过氧化氢有溶血能力，可在马鲜血琼脂上引起溶血。

（二）鸡毒支原体的发病机理鸡毒支原体一旦进入鸡体后，首先通过其表面的黏附蛋白吸附于上呼吸道黏膜相应的受体上，进而生长繁殖，引起上呼吸道特别是鼻道的炎症，由于黏膜的充血和浆液渗出，遂出现流鼻涕和打喷嚏症状；继而因鼻黏膜腺体分泌增强，鼻道充斥大量粘液。随着炎症的蔓延，受损的部位扩大至鼻邻近组织和眶下窦、气管、支气管、肺和气嚢等处。因气管内积存多量炎性渗出物，乃出现呼吸音。呼吸道内大量炎性渗出物的蓄积使空气进出受阻和呼吸容量减少而出现明显的呼吸困难，表明了呼吸道组织受损以及由此所产生的病变是本病发病学的主导环节。鸡的败血支原体感染按其性质是一种经过缓慢的传染病，当饲养管理条件良好时，疾病的发展很慢，有的几乎不显症状，而当饲养条件恶劣或伴有其它感染时，则病情显露和加剧。特别是混合感染时，出现的症状、病变比单纯败血支原体感染要复杂的多，其发病机理也不尽相同。本病最常见的混合感染是大肠杆菌、巴氏杆菌、鸡嗜血杆菌以及传染性支气管炎病毒等。例如当并发大肠杆菌感染时，常看到纤维素性心包炎、肝周炎、气嚢炎和腹膜炎；并发巴氏杆菌感染时，可见肝脏小灶状坏死，皮下、十二指肠、心外膜和心冠脂肪出血等变化。

另外，鸡毒支原体感染后，鸡虽然可以产生一定的免疫力，但鸡毒支原体在体内持续存在，主要是MG通过其编码抗原基因的相可变表达（开/关转换）和高突变，使其抗原特别是粘附素的高度变异，使它可以逃避宿主的免疫反应，而在宿主体内长期持续存在。

（三）鸡毒支原体的免疫机制MG感染鸡后，一般病鸡体内最先出现的是IgM，而后是IgG。有时在不同的菌株，也出现一些细小的差别，在R株感染实验中，病鸡会特异的出现IgM的两个峰值；而在F株感染试验中，则无此现象，抗体呈规律性出现。法氏囊在MG感染产生抗体的过程中具有重要作用，尽管抗体凝集滴度与气囊的攻毒保护率并不呈正相关，但确实会在野毒感染时减轻气囊的发病程度，说明抗体对抵抗MG的感染具有部分的保护作用。试验证明，给鸡注射大剂量MG抗体也不能抵抗MG强毒对气囊的攻击，带有母源抗体的雏鸡对MG强毒仍然易感，因此许多人认为鸡毒支原体病的免疫机理是以T细胞介导的细胞免疫为主。鉴于MG的感染首先是对呼吸道黏膜的一个吸附过程，所以，人们对于MG黏膜免疫的研究也发展起来，以期能为MG的防治提供依据。现代研究发现，无论是强毒、弱毒，包括灭活苗，均能诱发禽体产生IgA。高水平的卵黄抗体，可以阻断MG的垂直传播从而为雏鸡提供一定的保护力。

三、诊断

MG感染后，大多成年鸡表现为产蛋下降，蛋的品质下降，但往往很少显现临床症状，呈隐形携带，只有当它与其它病原协同感染时，才出现明显的呼吸道症状，这就为其临床诊断带来了困难。所以，在CRD的诊断中，往往要通过必要的实验室诊断达到确诊的目的。

血清学方法是临床诊断MG感染应用最普遍的方法，血清学试验呈阳性者，结合临床症状就可以在MG分离和鉴定之前作出初步诊断。用于检测MG的血清学试验很多，但都不同程度的缺乏特异性和敏感性。分子生物学方法也常用于MG的感染。

（一）MG病原的分离鉴定MG的分离鉴定是诊断本病最可靠的方法，也是最经典的方法，通常用人工培养基、鸡胚、组织培养物(鸡肾细胞培养物和鸡气管培养物)分离病原体。此法工作量大，耗费时间长，不适合于生产上的快速诊断和监测，从而限制了其在畜禽临床诊断中的推广应用。

（二）血清学诊断方法生产上常用血清学方法来诊断MG感染。常用的血清学方法有血清平板凝集试验(SPA)、血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验 (ELISA)和斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA)等。

1.平板凝集试验(SPA)。它是应用最广泛的检测方法之一，具有结果清楚、易观察、操作简单、快速敏感、重复性好等优点，是一种快速简便的诊断方法，虽然该方法会出现一些非特异性凝集反应，特别是当前养禽业灭活苗的大量使用，使假阳性的比率有所提高，但SPA用来检测IgM抗体是非常有效的。IgM是机体受到感染后，发生免疫反应最早产生的免疫球蛋白，这就为早期诊断提供了方便，该方法得到广泛的应用。

2.血凝抑制试验(HI)。主要检测血清中的IgG，HI具有特异准确的优点，可以进一步证实SPA检测的结果，但敏感性较差，操作繁琐。但由于MG野毒感染后，最先产生的是IgM，这也为CRD的诊断延迟了时间，一般情况下，在鸡感染后3周才能通过HI检测到特异性抗体；并且HI试验耗时间较长，且无商品化的试剂，限制了其在生产中的推广应用。

3.酶联免疫吸附试验(ELISA)。该方法特异性很高，适合大规模血清抗体的监测，也是一种快速的血清学诊断方法，特别是在当今规模化养殖的今天，为大量样本的检测提供了方便。Talkington等报道用ELISA检测MG抗体较血凝抑制试验敏感，而比血清平板凝集试验敏感性稍低，但特异性强。在方法的改进上面，出现了PPA-ELISA，Dot-ELISA，AC-ELISA，提高了ELISA检测方法的特异性及敏感性，使在临床推广中更具有意义。

（三）分子生物学诊断方法分子生物学方法是近几年来发展并且逐渐开始在生产中应用的诊断方法，其主要包括核酸探针和PCR方法，敏感性和特异性均较血清学方法高，并且可用于MG和MS的鉴别诊断。传统的分离培养费时费力，而血清学方法只是对抗体做出检测，且存在交叉反应性，所以并不能对CRD做出快速准确的诊断。随着分子生物学的发展，对病原的快速诊断技术得到了长足的进步，PCR方法越来越多的应用于支原体感染诊断，套式、半套式、多重、反转录等PCR方法相继被用于支原体的检测。在流行病学应用方面，屈小玲等将PCR方法应用于分子流行病学调查，取得较好的实验结果；邓显文等根据鸡毒支原体(MG)强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点设计合成2对特异性引物，可在较短的时间内鉴别出MG强毒株和弱毒疫苗株。由此可见分支生物学方法已经在鸡毒支原体诊断中得到广泛的关注和应用。

四、MG的疫苗研究进展

疫苗在现代规模化养殖中得到越来越多的应用，其在预防动物疾病中能起到非常重要的作用。研制新型的切实有效的疫苗是防制MG病的重要手段，也是绿色动物产品的发展趋势。临床上用以免疫接种的疫苗主要有两类：即灭活油乳剂疫苗和弱毒疫苗。

（一）活疫苗由于禽体的抗体水平与保护并不成正相关，机体以T细胞介导的细胞免疫为主，所以弱毒苗的应用，将是当前的重点。活苗研究始于20世纪70年代，国内使用的活疫苗为MG康涅狄克F株疫苗，其优点就是致病力极弱，且保护力较强，给1、3、20日龄的雏鸡滴眼接种，不会引起任何可见的症状和气囊病变，不影响增重。活苗研究中，日本、法国、美国分别将G250株、CP株、F株、ts-11株及6/85株制成疫苗应用，其中G250株、CP株由于毒力极度减弱，需频繁使用，效果不佳。现在，应用较广泛的有F株、6/85株和ts-11株。F株菌苗是性质相对较温和的株菌，F株比野毒株致病性低，在鸡产蛋之前和被MG野毒感染前使用可降低商品蛋鸡的产蛋损失，减少病原体经卵传递，该菌苗应用于不同年龄的产蛋鸡群，以降低MG引起的产蛋下降，MG弱毒常具有置换和传播功能，F株可通过置换强毒而使感染鸡得到保护，但是F株能经蛋传播，它引起的保护作用的生物学机制不涉及定植后进行附位点的竞争或阻断，并且F株不能阻止MG强毒株的定植。但连续2年使用F株菌苗免疫后备鸡群，MG野毒株即被置换掉。中国兽药监察所用弱毒株F-36制成的活疫苗免疫接种鸡，不影响鸡体增重，不引起气囊损伤，接种鸡不表现任何临床症状。该疫苗接种鸡，免疫保护率达80%，免疫期可达9个月。新近的研究结果表明，ts-11和6/85弱毒制作的疫苗比F株毒力更弱，对鸡和火鸡均无毒力，因此，近年来ts-11株和6/85更多的被作为商品化弱毒苗用于鸡和火鸡，此疫苗对未受MG感染的鸡有较好的免疫效果，也可用于火鸡的免疫接种，但免疫鸡体内检测不到抗体，不易判断免疫效果，对己感染MG的鸡群接种效果不如F株。

Ts-11株是通过化学诱变，经过温度敏感性筛选而得到，ts-11株菌苗在禽与禽之间传播很差，激发产生缓慢的低水平的循环抗体，对MG野毒感染具有保护作用。此菌苗免疫鸡群后，终生存在于上呼吸道中，并且能产生长期的免疫力。当禽群附近有易感家禽存在，必须进行MG疫苗免疫时，6/85和ts-11菌苗要好于F株。研究结果表明，在集约化饲养的条件下，用ts-11己能成功的根除MG。6/85株菌苗是一种冻干苗，在美国主要用于防止商品产蛋鸡产蛋下降造成的损失，6/85株菌苗对鸡的毒力很小，个体之间很少传播，并且能抵抗强毒株的攻击，F株菌苗比6/85和ts-11菌苗取代强毒株的能力强，并且能在多种年龄商品产蛋区取代野毒株；ts-11株菌苗可以在以前流行过F株的地方免疫其后备母鸡群，可取代F株。在美国一些种鸡场采用F株和6/85株或ts-11株的联合应用，即是利用F株置换野毒株，然后再用毒力更弱的6/85株或ts—11株置换F株，同时减少了弱毒株传播的范围，取得了较好的效果。但在国内当前MG的疫苗利用方面，并没有得到广泛认可。

（二）灭活疫苗20世纪50年代开始，许多禽病工作者即从事灭活苗研究，但效果不佳。Yoder等报道以MG油乳剂灭活苗对15～30日龄鸡免疫接种能有效地抵抗强毒株攻击，但用于10日龄内的雏鸡，免疫效果不理想。Stone(1987)报道了一种改良的油佐剂苗，可使雏鸡免受鼻内接种强毒的攻击，保护产蛋鸡群，不造成产蛋率下降，防止鸡的气囊病。宋勤叶等用MG油乳剂灭活苗接种蛋鸡，结果表明无论在试验攻毒前还是在攻毒后接种，均能有效地降低MG的蛋传率。SasiPreeyuan等报道，连续使用油乳剂灭活苗可以达到MG的净化。灭活苗可起到阻断经蛋传递的作用，但不能清除鸡体内的MG野毒，只能使感染时症状减轻，而不能阻止野毒的感染。Abd—Ei—Motelib等 曾 对 F、ts—11和6/85等3个弱毒株以及1个商业性灭活苗就其免疫效力进行了比较，疫苗接种鸡在致病菌株R株气溶胶攻击之后，各组剖检28只鸡检查气囊病理损伤结果，F株免疫组只有5只有极其轻度的损伤，损伤平均分为0.18，其它3种疫苗接种鸡出现气囊损伤平均分为1.21～1.89，而灭活疫苗接种组与未接种疫苗的对照组相差无几，均明显不如F株。

油佐剂疫苗存在导致注射部位组织增生及吸收慢等缺点，蜂胶是一种天然复合物，含有多种类的类黄酮化合物，包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类以及黄烷酮醇类，具有广泛地免疫效应，可以全面的启动机体的免疫防御体系，增强特异性免疫和非特异性免疫，免疫保护期延长。除此外，蜂胶佐剂疫苗注射后对局部无病理性损伤，且吸收快，因此开发蜂胶佐剂疫苗对预防该病将起到积极的作用。蜂胶苗加倍注射的安全性良好，注射部位无肿胀、无坏死、无感染，鸡群生长发育状况正常。免疫组在强毒攻击后，体重增加基本不受影响，对鸡群的平均保护率在80%以上，说明蜂胶支原体灭活疫苗能有效防止鸡气囊炎的发生。

我国鸡场中MG感染普遍，预防控制难度很大，因此必须根据我国的实际情况，加强对该病危害性的认识，采取以疫苗接种为主、药物治疗为辅、加强饲养管理及环境净化控制的综合防治措施，使该病早日得到有效控制。

（三）生物技术疫苗由于目前用来防制MG的灭活疫苗和弱毒疫苗均存在着不同程度的缺陷，再加上MG培养困难和不同地区分离的毒株抗原性存在差异，常规疫苗的局限性愈来愈明显，故利用生物技术手段开发新型疫苗已势在必行。新型疫苗包括核酸疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、合成肽疫苗等。

分子生物学研究发现鸡毒支原体结构蛋白中的29kDa、64kDa等蛋白具有良好的免疫原性，而且这些基因已被克隆并进行了序列测定，有望作为基因免疫的良好的免疫原性基因。从理论上讲基因免疫是克服众多疫苗免疫效果不佳或负作用较大的理想手段，但由于目的基因在动物体内表达的蛋白质分子量小，免疫原性弱，很难诱导动物产生坚强免疫，在这种情况下，人们纷纷寻找新的免疫增强剂。近年来，大量研究证实，白细胞介素-2、白细胞介素-6等是理想的细胞因子类免疫增强剂，而且这些基因已被成功克隆，并在动物体内表达成功。因此构建IL-2与其它抗原基因共同表达的质粒将是新一代DNA疫苗或基因免疫的发展趋势，这种方法比IL-2与疫苗混合使用或IL-2基因表达质粒和目的抗原基因疫苗混合使用的方法更进一步，以此种方式获得的重组蛋白，不仅可以提高疫苗的效果，也可以整体上增强动物的免疫力。所以，用MG的某些蛋白基因与鸡IL-2或IL-6基因联合进行基因免疫很可能对预防鸡毒支原体的感染提供新的途径。虽然针对MG的基因工程疫苗的研究不如一些病毒基因工程疫苗研究的多，也没有病毒基因工程疫苗研究的深入，但MG基因工程疫苗的研制无疑为预防和控制慢性呼吸道病指引了一个新的研究方向。