禽支原体病最新诊断标准

奚德华，罗坚强，王姣

（常州市动物疫病预防控制中心，江苏常州 213015）

鸡毒支原体（MG）和滑液支原体（MS）属于柔膜体纲，支原体目，支原体科。虽然火鸡支原体和衣阿华支原体也可以引起家禽的疾病，但MG和MS是致病支原体中最重要的，并且在全球广泛传播。

MG感染在鸡和火鸡中十分重要，会造成呼吸系统疾病、肉蛋产量减少。它也会造成禽的上呼吸道病。最近在北美发现，MG会引起家雀结膜炎。在家禽中，MG感染可通过种蛋垂直传播，也可通过密切接触水平传播，环境样品中可鉴定出MG特异性核苷酸。目前尚未证实有其它传播方式。

MG和MS感染的确诊手段主要有：分离培养、血清学方法或从感染组织/棉拭子样品中检测DNA。尽管疑似样品可以接种鸡胚或鸡，但由于结果不可靠，常需要重复采样诊断。

一、病原鉴定

（一）临床鉴别诊断及样品采集MG感染的临床症状常表现为亚临床到明显的呼吸道症状，包括鼻炎、结膜炎、咳嗽和喷嚏，有时会出现鼻腔分泌物，音和张口呼吸。严重时出现眶下窦肿胀以致眼睑闭合，一侧或两侧鼻窦炎也是特征之一。这一症状在火鸡和赛禽中尤为突出。在火鸡和赛禽中，还伴有泡沫状眼部分泌物的结膜炎特征（鸡偶有出现）。为了去除眼部分泌物，火鸡常造成翅羽及伤口污染。除了结膜炎，感染的家雀还会表现出眼部和鼻腔分泌物和眼睑肿胀的症状。鸡毒支原体可能与鸡和火鸡的急性呼吸道病有关，特别是幼禽和火鸡更易感。一些病毒如新城疫、传染性支气管炎和一些细菌病如大肠杆菌的继发感染在很大程度上影响了疾病的严重性。在火鸡中，禽肺病毒与支原体有协同作用，会引起长期的慢性病及种鸡和蛋鸡的产蛋减少。最初出现的呼吸道病变是粘液性渗出液，随后出现卡他样和干酪样渗出物，这些渗出物可能会在气囊中形成纤维素样渗出，形如块状。在火鸡和赛禽肿胀的眶下窦中包含粘液样至干酪样渗出物。

鸡MG或MS感染常与其它一些病原，如新城疫的弱毒株和鸡传染性支气管炎所引起的呼吸系统疾病混淆。这些病原常与MG或MS混合感染，而禽副嗜血杆菌和多杀巴氏杆菌则不能。在火鸡中，MG感染常与禽肺病毒感染混淆，而出现气囊炎这一典型症状亦并非MG感染特有，在大肠杆菌、多杀巴氏杆菌、衣原体或MS也能发生这样的病变。MS能引发的传染性滑液囊炎，在鉴别诊断时，要与金黄色葡萄球菌感染和呼肠孤病毒引起的感染性腱鞘炎相区别。

感染滑液囊支原体的鸡常表现鸡冠苍白，跛行和生长缓慢，关节肿胀，常见含大量尿酸盐的绿色粪便。关节和腱鞘处可见粘稠的乳白至灰色渗出物，肝脾肿大，肾肿大，有花斑。呼吸道症状和病变与MG类似，只是MS表现轻微些。和MG一样，MS也与其它呼吸道致病因子有协同作用。MS不同毒株之间在毒力和组织嗜性上差异极大。

从活鸟、活禽或新鲜冻存的禽肉产品。对于活禽，采集鼻腔、口咽、食道、气管、眼、泄殖腔棉拭子样品；对于死禽，则采集鼻腔、眶下窦、气管或气囊等部位样品，分泌物可由眶下窦和关节腔中吸取。临床样品可通过从死胚或破壳但未孵化成功的雏鸡体内采集，可从胚胎的卵黄膜内表面、口咽和气囊获得。

（二）病原分离和培养在采集后，所有待检样品需尽快进行检测。在运输过程中，最佳方式是将小片组织置于支原体肉汤中，而棉拭子则在1～2 ml支原体肉汤中剧烈振荡后弃去。可以将棉拭子浸泡于支原体肉汤中，随后再用于样品采集。在运输过程中，需加冰袋或者其它制冷措施保持低温状态，因为MG和MS在室温下很快就会死亡。在支原体肉汤中，样品需要进行倍比稀释，因为组织中常存在特异的抗体、抗生素或抑制因子，可能抑制支原体增殖。

目前已有几种用于分离培养的培养基，可通过Mycoplasma Experience、Reigate、Surrey 或United Kingdom购买。支原体培养基通常含有蛋白质消化液和肉浸液基础，需要添加血清或血清组分、酵母提取液、葡萄糖和细菌抑制剂。非常重要的一点是：每一批新的培养基都需要通过最近分离的体外低传代MG分离株进行测试，因为一些组分，特别是酵母提取液和血清批次差异很大。

（三）生物学鉴定生化反应（如发酵葡萄糖、不水解精氨酸）可以帮助鉴定，但这不是MG或MS特有的，也不是克隆纯化所必需的。

免疫学和DNA检测方法可以用来鉴定支原体分离株，包括间接荧光抗体技术（IFA）和免疫过氧化物酶检测法（IP），这两种方法简易、敏感度高且特异性强。检测方法还包括生长抑制检测（GI）和代谢抑制检测（MI）。纯化（克隆）培养物对GI和MI检测技术而言是必须的，但对IFA和IP检测则不是。IFA和IP可以检测不止一种支原体的存在，而只有特异性血清才会与相应的纯化克隆起反应，而其它则不反应。然而，在鸭、鹅和一些野生鸟类体内常会分离到模仿支原体，与MG有相同的生化特征，与MG有血清学交叉反应。该支原体可按Kempf等建立的PCR-RFLP（多聚酶链式反应/限制性内切酶片段长度多态性）诊断法，将其与MG相区分。抑或者用MG和模仿支原体的单菌落做平行试验，对连续稀释的抗血清做免疫荧光检测，这要求抗血清要有较高的滴定才行。

上述方法并不能确诊，还需接种鸡胚或动物接种法进行细致鉴定，但这耗时耗力，因而现在逐渐被PCR技术所取代。就像在人工培养基中一样，支原体也可在鸡胚中增殖，具体做法是：将它们接种于不含醋酸亚铊的肉汤中，37℃培养30～60 min，然后取0.05～0.1 ml量接种6～8日龄无支原体感染鸡胚的卵黄囊，每天照胚，若鸡胚在24 h内死亡则弃去，超过24 h死亡的鸡胚都冷冻至培养结束，超过5 d仍未死亡的鸡胚可以放于4℃冰箱4 h使其死亡以减少收胚时的出血。收集卵黄液在肉汤或固体培养基中传代培养。卵黄液形成的菌落可能并不清晰，因此需要划线使卵黄变薄或初次在接种支原体肉汤培养时将卵黄稀释，以获得更好的效果。

动物接种法是将可疑组织的匀浆液接种4只8～16周龄对支原体易感的无支原体感染的SPF鸡。如果这些鸡体内存在支原体，能证实其DNA或/和存在特异性抗体，才能确诊。

二、免疫学方法

免疫荧光和IP法对实验室分离株是普遍适用的诊断方法，而不直接适用于感染渗出液和感染组织，这是因为支原体体积太小，在光学显微镜下无法鉴别，而且相应的阳性和阴性对照渗出液/组织不容易获得。

（一）间接荧光抗体试验(IFA)IFA试验的推荐方法。这一方法适用于鉴定在琼脂板上长出明显菌落的支原体，步骤简述如下：①从长有菌落的琼脂板上，切下1.0 cm×0.5 cm大小的一块，菌落向上放置在标记过的载玻片上；②为了避免以后弄错方向，在样品块的右下角切下一块作为标记。在一个载玻片上放置一块未知的分离株、一块MG培养物、一块MS培养物以及另外一个不同种的已知支原体培养物。另一个载玻片上放置一块未知的分离株；③在第一个载玻片上的每个样品块表面滴加一滴适当稀释度的MG（或MS）抗血清，在第二个载玻片上的样品块上滴加正常兔血清；④所有样品块放在湿盒中室温孵育30 min；⑤将每一个样品块分别放入一个标记好的含有PBS（pH7.2）的指形管中，在涡旋振荡器上洗洗2次，每次10 min，最后再把样品块放回相应的载玻片上；⑥吸去载玻片上样品块的多余水分，在每个样品块上滴加一滴适当稀释的FITC标记二抗，同前孵育及洗涤；⑦将样品块放回相应原来的载玻片上，然后用荧光显微镜检测菌落荧光。这个结果的判定是主观的，需要一定的专业知识。与对照进行比对是必需的，并且这些对照必须是预期的反应。一些实验室也使用直接荧光法（DFA）进行检测，即利用荧光素标记抗血清。在DFA试验中使用比较广泛的一种技术是，在支原体琼脂平板上放置一个不锈钢圆筒，里面不间断的提供试剂。虽然操作快速简单，但是所获得结果的特异性比间接方法要低，因此还是首选间接荧光法。

（二）间接免疫过氧化物酶检测法(IP)此方法的原理与IFA试验相似，只是特异性抗体与菌落的原位结合通过添加过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白来检测。阳性对照为相应的底物，氧化后可以产生有色菌落。

这样的免疫结合过程也可以先将菌落印迹在NC膜上，然后用类似的方法进行反应。和IFA试验一样，IP试验可使用多抗血清来进行分离株的血清分型。IP试验超越免疫荧光方法的优点在于IP试验不需要昂贵的荧光显微镜。

（三）生长抑制试验(GI)在GI试验中，支原体的生长被特异性抗血清所抑制，从而可以进行种类鉴定。相对来说，此方法不太敏感，所用血清必须高效价、单一特异性，并且在哺乳动物宿主体内制备，因为禽类血清常常不能有效抑制支原体的生长。试验中的支原体必须是纯培养物，并且应当检测数个稀释度，以104CFU/ml的浓度最合适。支原体的生长率会严重影响实验结果，先27℃培养24 h，然后再在37℃培养，则会使生长受到阻碍。

三、核酸检测法

常规培养和检测的另一种方法是使用特异DNA检测法。MG或MS可以用DNA杂交探针来检测，但是现在更常用的是用PCR来扩增检测材料中一段特殊的DNA片段。目前至少有一种商品化的MG DNA试剂盒，可以用棉拭子提取物直接进行PCR鉴定。分子生物学方法也可有效用于区别MG和MS株，但是迄今为止，这些方法只能在专门的实验室进行。一种快速精确的方法是：DNA指纹印迹图谱技术，即利用随机引物PCR或随机扩增多态性DNA（RAPD），该方法可复制性好，使用的PCR引物是随机的，且长度较短，快速易行，被证实对MG流行病学调查十分有效。但是，该方法要求不同菌株必须在同一块凝胶中进行跑胶。而且，看似相同的条带模式解释也是非常困难的。

四、血清学检测

血清学检测通常缺乏特异性和/或敏感性，最好用来检测群体感染，而不是检测个体。要用这些试验进行诊断时，须建立这些检测的敏感性和特异性。但值得注意的是，这些血清学试验对老龄禽类和猎禽无效。

最常用的方法是快速血清凝集试验(RSA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)和血凝抑制试验(HI)，还有其它的方法，如放射免疫测定法、微量免疫荧光法和IP测定法等。一个群体的血清测试范围取决于检测限和可信度。国际行业对该检测的最低要求和测试范围有规定，如European Communities Council Directive 90/539/EEC和 美 国NPIP成员国。

家禽公司常用ELISA技术来大规模监测病毒的抗体滴度，这种方法对于支原体检测也同样很适用。在此不具体描述ELISA技术的细节，因为很多MG试剂盒已经商业化，相反，HI试验还没有商业化的试剂盒，所以下面会提到HI试验的细节。

（一）快速血清凝集试验血清采集自某个鸡群，在72 h内，如果不是立即检测，贮存于4℃保存，请勿冷冻。检测应在室温（20℃～25℃）下进行，试剂也放在室温下即可。在检测之前离心血清，可以减少非特异性。RSA抗原已经商品化，但不同的生产厂商和批次，其特异性和敏感性也会不同。购买的抗原必须按生产厂商的使用说明书保存。合适的RSA染色抗原也可自制，如用结晶紫染色。

在美国，MG和MS阳性参考血清可以从USDA国家兽医服务实验室（NVSL）获得，欧洲可以从法国的AFSSA Ploufragan获得。不同滴度的鸡和火鸡的MG、MS和对照血清都能买到。成套的抗血清也可以在Georgia大学禽病室购买到。

国际上还没有标准来判定该试验结果，但一个群体的血清阳性率高（10%或更高）则表明有MG感染，尤其经HI试验或ELISA验证的。对于进一步验证，该群体需要在一个月内反复测试。不确定的结果需要分离培养或鉴定其DNA的存在。MG的疑似结果可以用MS抗原交叉检测（反之MS亦然），因为这些病原有时会交叉感染。卵黄和血清一样，也可以做此检测，但卵黄必须先稀释或提取出来。

（二）血凝抑制试验MG和MS可以凝集禽红细胞（RBCs），血清中的特异性抗体可以引起抑制。需要挑选长得好且确定有血凝抑制的菌株。HI试验需要血细胞凝集性良好的MG和MS抗原、洗过的新鲜的鸡或火鸡RBCs、合适的待检血清。抗原可以是在新鲜肉汤培养基上的或是PBS浓缩洗过的支原体细胞混悬液。要长期保持高滴度的肉汤培养抗原是很困难的。尤其是使用浓缩抗原（通常含有25%～50%甘油，冻存在-70℃）会增加非特异性反应的可能性。在美国，MG和MS血凝试验（HA）抗原可从NVSL购买。

HI试验可以按已知步骤进行。抗原的HA滴度由倍比稀释检测获得。完整的HA试验体系可以确定最小抗原量的HA单位。HI试验是用HA的4单位抗原进行或用有同样敏感度的已知阳性血清检测法。

非特异性HA血清必须去除所有非特异性血细胞凝集，所以没有HA抗原的对照孔会出现清晰的沉淀。用1 ml血清稀释液加6～8滴鸡或火鸡的RBCs，37℃培养10 min后取出细胞，上清检测血细胞凝集活性。

对于判断阳性和阴性结果国际上还没有官方的标准，但美国的NPIP认为，1/80或者更高滴度的为阴性，1/40滴度的就十分可疑了。

（三）酶联免疫吸附法一些MG和MS抗体ELISA试剂盒已经商品化。其灵敏度会因为不同生产厂商阳性和可疑反应的终止水平而不同，有时则刻意降低敏感度来避免MG和MS之间的已知交叉反应。ELISA用MAb来识别位于MG 56kDa上的抗原表位。在这种试剂盒中，和常用的间接ELISA一样，ELISA板用全菌包被，以结合MAb加入时封闭程度来评价的。MS的ELISA试剂盒是类似的。这种试剂盒的优势是可以适用于所有禽类血清。

鸡毒支原体和滑液支原体抗原的质量要求：

（1）鸡毒支原体抗原。抗原通常 由MG的S6株 和A5969株制备获得，其他菌株也可以用于制备抗原。

用于RSA的MG抗原：下述质量控制只针对用适宜染料染色并含保存剂的MG株混悬液。这种抗原已经商品化。镜检下，抗原应该是均匀的混悬液，没有絮状物或沉淀，也没有残留的染色剂，还要避免细菌和真菌的污染。PH须在6.5～7.5±3℃保存，使用前要预热至室温。抗原的敏感性和特异性取决于它与已知不同滴度的阳性血清和已知阴性血清的反应性。阳性反应会出现有色的絮状物，培养液澄清。以上描述的判定标准在生产厂商标注的有效期内都适用。用于HI试验的MG抗原：试验最好使用生长旺盛期的活菌进行。抗原必须避免细菌和真菌的污染。用于ELISA的MG抗原：如果没有先前的大量试验和对敏感性和特异性的确定，要制备用于间接ELISA的令人满意的抗原是十分困难的。大多数实验室诊断最好的方法是使用可靠的商品化试剂盒。一些试剂盒是USDA认证的，可以在美国的NPIP中使用。

（2）滑液囊支原体抗原。抗原通常由WVU1853毒株制备，其它菌株也可以使用。用于RSA的滑液囊支原体抗原：其规则和制备用于RSA的MG抗原相似。用于HI试验的滑液囊支原体抗原：其规则和制备用于HI试验的MG抗原相似。

（3）附加注释。RSA中非特异性反应的血清不一定在用HA抗原的HI试验中呈阳性反应。初次感染后2～3周（HI抗体产生所需时间）的血清进行HI试验可确证RSA阳性反应。但HI试验具有菌株特异性，因此敏感性不强。ELISA是另一种有效的选择。血清样品在RSA试验前无需冷冻，要避免溶血和污染而导致的非特异性反应。其它疾病灭活疫苗的使用亦会导致非特异性反应。样品检测越早进行越好（72 h之内），因为支原体抗体在保存过程中会变质。血清需在56℃水浴30 min灭活。

（略）