化感物质的提取、分离及鉴定方法的研究

陈绍莉 周宝利

（辽宁省果蚕管理总站 110034）（沈阳农业大学园艺学院）

化感作用属于化学生态学的研究范畴，是一门新兴学科。化感作用的英文为 “Allelopathy”，源于希腊语“Allelon（相互）”和“Pathos（损害、妨碍）”。1937年Molish首先将其定义为：某种植物（包括微生物）生成的化学物质对其他植物产生某种作用的现象。随着科学研究的迅速发展，对化感作用的认识也在不断深入和全面。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中将其较完整地定义为：植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物的有利或不利的作用。化感作用在生态系统中普遍存在，并通过化感物质对受体起化感作用。因此，对化感物质的认识及研究十分重要，其中，提取、分离和检测化感物质是正确、全面认识化感现象的前提。

1 化感物质的种类

迄今为止所发现的化感物质主要有：水溶性有机酸、直链醇、脂肪族醛和酮、简单不饱和内酯、长链脂肪酸和多炔、醌类、简单酚、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素类、类黄酮、单宁、内萜和甾类化合物、氨基酸和多肽、生物碱和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等。其中，最常见的是低分子量有机酸、酚类和内萜类化合物。

2 化感物质的提取方法

化感物质可以通过浸析、挥发、植物残体分解和根系分泌等方式进入环境中。根据化感物质的作用途径，通常分别采用夹层法、常温吸附法、浸提法或腐解法和疏水性根渗出液连续收集法（CRETS）等方法提取。化感物质的复杂性，使得化感物质的提取收集比较困难。

目前，人们最常用的是浸提法收集化感物质。浸提剂主要是两类化合物：一是无机化合物，如：H2O、NaOH、Na4P2O7等；二为有机化合物，如：甲醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇等等。土壤中的化感物质主要是以游离态和可逆束缚态的形式存在于土壤溶液中，选用NaOH和Na4P2O7作为浸提剂可将植物残体和土壤有机质中的酚酸类物质提出；有机溶剂（如：氯仿）能够直接从枯枝落叶、土壤腐殖酸和微生物膜中提取出化合物，但是，使用有机溶剂提取出来的化感物质与自然条件下所产生的在质和量上均有所区别。所以，选择浸提剂时应全面、慎重地考虑，以便使检测结果更加真实可靠。

在浸提过程中，一般采用往复式振荡和索式提取的方法进行，然而这些方法在处理样品时，浸提时间较长并且浸提不完全，样品容易损失。另外，还可以采用超声波方法浸提，由于超声波深层的超声破碎作用，从理论上说能够省时，并且浸提更加完全，但实际操作条件还有待于进一步的研究。

Tang和Young提出的连续抽提系统比溶剂提取方法更有效，并有助于从未扰动的根际中分离和鉴定化感物质。最近，刘秀芬等在减压条件下，用带有多孔陶头的塑料管原位收集土壤溶液，并成功地鉴定出了以前未见报道的化感物质对二叔丁基苯甲酸，其对玉米和小麦生长发育的抑制作用明显强于同浓度的常见化感物质苯甲醛和阿魏酸。另外，同位素示踪技术的应用使得在自然环境中进行根系分泌物的研究成为可能。Meharg等用14CO2标记黑麦草，在温室中成功地进行了土壤微生物作用下根分泌物的研究。有时，为了强调防止某些化感物质被氧化，必须在充满氮气条件下进行提取。

3 化感物质的分离和纯化

提取得到的混合物必需经过纯化才能进行仪器检测。常见的纯化方法有：萃取法、树脂法和层析法。

3.1 萃取法

根据化感物质在两个不相溶或部分互溶的溶剂中的分配度（溶解度）不同，从而达到分离纯化的目的。此法虽操作繁琐，不够精确，但由于所用器械简单方便，快速易行，现在仍被广泛使用。由于化感物质在常用有机溶剂（如：乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷等）中的溶解状况不同，可以使用不同有机溶剂反复萃取将含有的化感物质全部提出来。

3.2 树脂法

这是近年来发展起来的一种新方法，根据分离机理不同，分为交换法和吸附法。交换法是利用阳离子和阴离子树脂，吸附阴阳离子，无极性或极性较弱的有机分子通过，然后洗脱和提取目标组分，从而达到纯化的目的；吸附法则是使用吸附树脂 （如：XAD-24、XAD-22或GDX-2102树脂以及硅胶等）吸附和富集含化感物质在内的一些有机化合物，达到分离和纯化的目的。

3.3 层析法

一般常用纸层析和柱层析法分离和纯化化感物质。自从Rulen在本世纪中叶提出用柱层析测定植物组织中的有机酸后，层析法便被广泛地用于土壤中化感物质之一的有机酸的研究。但柱层析法手续繁复，且时间长；而纸层析和薄板层析法虽操作简便，但不够精确，所以它们现在基本上已不作为检测手段了。

4 化感物质的鉴定

化感物质多数为次生代谢产物，数量甚微，而且有的易挥发或在空气中易发生化学反应，因而，其检测方法在很大程度上依赖于科学技术的进步。近年来，近代实验物理方法在化学分析上的应用给新发现的化感物质结构的测定带来了比较简单而准确的方法。根据测定熔点、红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁共振谱等参数来判断其中存在的功能团、共轭体系、该未知物质的分子量和结构以及H原子和C原子在分子中的结合方式等信息，确定其化学结构，最后根据测定的结构用已知的标样或合成的标样来鉴定化感物质的含量。

伴随着科学技术的不断发展和现代化仪器设备的更新换代，特别是电脑分析控制程序的普遍应用，利用气相色谱（GC）技术、高效液相色谱（HPLC）技术和气相-质谱联用（GC-MS）技术研究化感物质获得了很大的发展。其中，可由GC分析的物质，其沸点在500℃以下，分子量要小于450，而热稳定性差、易于分解、变质以及具有生理活性的物质，不适合使用GC检测，GC所分析的物质占有机物总数的15%～20%；HPLC的使用范围较广，可检测的物质占有机物总数的80%～85%，但在HPLC广泛应用的同时，GC仍然发挥着重要作用。把色谱仪的分离装置作为质谱仪的进样系统，把质谱仪作为色谱仪的检测系统，即把色谱仪的高分辨率和质谱仪的高鉴别能力结合起来，组成GC-MS或液相-质谱联用（LC-MS）仪器，是目前解决复杂未知物定性问题的最有效工具之一。

植物化感作用机理及应用的研究，已成为当今的热点之一。为了更好的研究化感作用，研究的方法也要不断进行完善和探索，逐步建立一套操作简洁、检测快速、批量筛选、针对性强和检测结果可比性好的体系，加速其在农业生产实践中的应用。