BRCA1基因变异与乳腺癌相关性的研究进展

(南京大学医学院临床学院,南京军区南京总医院,普通外科,江苏南京,210002)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,有乳腺癌家族史的妇女中,15%～20%存在BRCA1的细胞系突变[1],BRCA 1(breast cancer susceptibility gene 1)是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因,该基因以常染色体显性遗传方式遗传,并有很高的外显率。自BRCA1基因成功地定位、分离后,国内外学者对其进行了广泛、深入的研究。女性BRCA 1变异携带者一生中发生乳腺癌的风险达60%～80%[2],在我国的许多大中城市,乳腺癌已占妇女恶性肿瘤死因的首位,严重威胁着妇女的健康。现将近年来的研究进展综述如下。

1 BRCA1定位、克隆及检测方法

1990年Hall[3]等通过对23个乳腺癌家族进行基因连锁分析,发现约 40%家族与 D17S74(17q21染色体上的一个标志)连锁,而且患者的平均诊断年龄在46岁以下,因此认为早发性家族性乳腺癌与 17q21上的基因突变有关。M iki等[4]利用定点克隆技术进行鉴定,首先从该区获取65个候选序列,经过详细的序列分析、碱基比较、转录分析和基因结构比较,发现3个产生单一转录单位的基因即HER2、HOX2和INT,经鉴定为BRCA 1,定位在17q21区的中间大约100kb区域内,位于两遗传标志D17S1321和D17S1325之间,并跨越 D17S855。Narod等[5]调查了 5个大的遗传性乳腺癌/卵巢癌家族,验证了Hall等[3]的发现并提出该基因亦是遗传性卵巢癌的易感基因。

BRCA1基因变异检测方法:提取癌组织DNA,经PCR扩增后进行单链构象多态性分析(SSCP),取凝胶带上出现异常条带者相应的PCR扩增产物,行双向测序,判断有无基因突变。另外还有直接测序、蛋白截断实验(PTT)、微卫星不稳定(M SI)等。

2 BRCA1结构和功能

基因结构分析发现BRCA 1基因分布在大约100 kb区域内,含有24个外显子和22个内含子,exon1不参与蛋白质的编码,exon4编码A lu重复序列,该重复序列在部分转录物中不存在。有22个编码外显子,其中exon11占总表达序列长度的60%,BRCA 1具有异常高密度的A lu重复序列,而其它重复序列密度相对较低,其中22个编码的m RNA长度为718kb。人类BRCA 1蛋白由1863个氨基酸残基组成,分子量为180 000-220 000 D,与任何已知蛋白无关联。BRCA1蛋白具有以下特征性结构域:N-端的锌指结构域(ring finger domain),是蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用的主要作用域[6];核定位区,负责编码2个核定位信号(NLS1和NLS2),其中NLS1能与核转运信号受体亚基importin-α相互作用,是BRCA 1核转运所必须的;Rad51结合区,与DNA损伤修复蛋白Rad51结合;粒素区(granin)位于 1214-1223氨基酸残基之间;BRCT区,C-端含有2个长约95个氨基酸残基的BRCT基序(brca carboxyl terminusmotifs),对细胞周期监控、DNA损伤修复起重要作用。两个BRCT交界处形成了一个疏水沟,能够识别磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸等,乳腺癌时这一区域常发生突变[7];转录活性区,BRCA 1蛋白C-端富含酸性氨基酸,提示该区具有转录激活作用。

从BRCA1蛋白质的结构特征可以看出:BRCA 1能与许多抑癌蛋白共同发挥抗癌作用。该蛋白质N端带有一个环指结构域,该环指结构域能与ATF1、BARD1、BAP1和 EF21基因相互作用;该蛋白质的中段带有一个核定位信号序列,以及与c-myc、p53、RB和DNA损伤修复蛋白RAD50/RAD51等相关的结构域;其C端带有两个BRCT结构域,该结构域能与多个基因相互作用,如 p300、p53 、CBP、BRCA 2 及 BACH 1、RNA聚合酶Ⅱ等,BRCA 1基因突变与BRCT结构域的缺失有关。BRCA 1基因的突变则导致BRCA1编码的蛋白质从细胞核进入细胞质中,丧失了与DNA结合的能力。BRCA 1基因在数量和结构上的突变是来源于实体肿瘤的细胞的显著标志[8]。

2.1 DNA损伤修复

BRCA1被认为是基因组的看护者,在DNA修复中起重要作用,维持基因组的完整。其DNA修复功能主要表现在它与其他修复蛋白间的相互作用及相关复合体的形成方面大量研究资料表明,BRCA1作为一种抑癌基因,在正常乳腺上皮细胞核内起重要的转录调控作用,参与细胞周期的调节,抑制细胞增殖,促进细胞终末分化,诱导细胞凋亡和参与细胞DNA损伤修复,维持基因组的完整,是一个重要的细胞周期负调控子。

2.2 转录活化与抑制

BRCA 1具有转录活化和转录抑制双重作用,N-端的锌指结构具有DNA结合功能,C-端的“酸性集团”具有反向激活功能,在转录过程中具有重要的调控作用。一方面,BRCA 1蛋白C-端的酸性区与GAL4 DNA结合域结合后,充当转录启始因子,激活细胞周期调节因子P21和MDM 2转录;另一方面,BRCA 1能抑制与细胞增殖相关基因的转录,如C-myc的转录。另外,BRCA1还可抑制雌激素受体的转录。

2.3 细胞周期的调节作用

正常情况下,BRCA 1蛋白可与细胞周期素依赖性激酶及细胞周期素A、D结合,随细胞周期的时相变化,呈现磷酸化和去磷酸化两种状态的互换:在G1晚期和S期呈现高度磷酸化状态,在M期后转为去磷酸化状态。因此,BRCA1可能对细胞周期的正常运转起一定的作用。当DNA受损时,BRCA 1作为一种负性调控因子,参与细胞周期检控点的调节。G1/S期,BRCA1以锌指结构域作为蛋白质-蛋白质相互作用的主要作用域,通过转录因子E2F的作用和细胞周期蛋白-CDKS复合物的磷酸化,抑制细胞进入增殖周期,阻止细胞分裂,诱发细胞凋亡。BRCA 1蛋白还可通过CDK抑制因子p21waf1使细胞周期停滞于S期;通过调控有丝分裂中纺锤体组装,参与G1/S期检控点的调节;通过激活Chk1激酶使细胞周期停滞于G2/M期。最近研究发现DNA损伤后,BRCA 1蛋白受DNA损伤检控点调节蛋白1(MDC1)的调节,在损伤部位聚集、磷酸化,从而调控细胞周期S期和G2/M期检控点,引起细胞周期停滞[9]。

2.4 中心体的复制

中心体复制是在精确的调控下进行的,正常细胞周期只进行1次复制。这一过程失调可引起中心体扩增(amplification),染色体不对称分离,非整倍体增加,最终导致肿瘤形成。BRCA1在中心体复制中起负性调节作用,其突变细胞可导致中心体扩增。BRCA 1与中心体的重要成分γ-微球蛋白(γ-tubulin)之间存在相互作用,而γ-微球蛋白负责微管及有丝分裂纺锤体的形成。

BRCA1的鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中有25%的细胞具有两个或两个以上中心体。在有丝分裂期,这些中心体形成多极纺锤体,拉动染色体向不同方向运动,引起染色体不对称分离及微核形成。证明了BRCA1在调节中心粒复制过程中的重要作用[10]。Hsu等[11]发现BRCA1与γ-微球蛋白的作用区域位于外显子11编码的第504-803氨基酸之间,称之为BF3(BRCA1 fragment NO.3)。BF3与γ-微球蛋白共同表达,共同免疫沉淀于细胞内。进一步的研究表明BF3过度表达可导致中心体扩增。

3 病理学特征

3.1 组织学特征

BRCA 1相关乳腺癌的组织病理组织学级别较高,多为3级;病理类型倾向于髓样癌和非典型性髓样癌,且非整倍体较多,瘤细胞增殖率较快。1997年的1项大规模国际乳腺癌协作研究显示,BRCA 1变异组的细胞分裂指数和核多形性高于对照组,腺管形成较少;BRCA 1变异组和对照组在浸润性导管癌和浸润性小叶癌的发生率上无明显差异;BRCA1变异组的导管原位癌和小叶原位癌的发生率低,但无显著性差异[12]。但也有研究发现,BRCA1变异组的导管原位癌发生率远高于无变异的对照组[13]。

3.2 免疫组化特征

A rmes等[14]对早发性乳腺癌研究表明,BRCA1变异携带者表现为P53和Ki-67表达水平增高,cerBb-2、ER、CyclinD1的表达较低,而Cathepsin D和E-cadherind的表达与散发乳腺癌患者相比无显著性差异。Robson等[15]研究了58例BRCA 1变异的犹太乳腺癌患者,发现BRCA1变异组的Ki-67表达增高,ER、HER2/neu(cerBb-2的癌基因)常为阴性,在BRCA1基因变异的病人中,三阴性乳腺癌的比例越来越高[16],但Cathepsin D、bcl-2、P53、P27、表皮生长因子受体、CyclinD1的表达较对照组无显著性差异。

3.3 淋巴结转移

对BRCA 1的变异与乳腺癌的淋巴结转移的研究结果尚存在一定的分歧。有研究发现BRCA 1基因变异者的腋窝淋巴结转移率高,而A rmes、Robson和 Eisinger小组[14-15]却未发现上述差异性。我国学者孙靖中[17]对30例青年乳腺癌进行研究,发现腋窝淋巴结转移的乳腺癌BRCA1变异率显著高于无转移者;淋巴结转移率越高,BRCA1变异率越高。

3.4 相关影像学特点

Veltman J[18]等研究表明,乳腺X线摄影及MRI提示:存在BRCA基因变异的乳腺癌,乳腺X线摄影常常具有与良性病灶相似的形态特征,如圆的外形或清晰的边缘,有时难以鉴别。不过,通过MRI中增强模式及动态增强技术的应用,提高了在这些情况下,那些易于与良性病变混淆的恶性病灶的鉴别率。Granader,E J[19]的研究也建议对于存在BRCA基因变异的妇女,采用MRI较乳腺X线摄影有更好的恶性病变诊断率。

4 BRCA1变异与家族性乳腺癌

BRCA 1是一个很大的基因,发生变异的位点多,且检测手段复杂。迄今已检测到的变异不下300种,这些变异分布在BRCA1基因的整个编码区。包括大多常见突变类型:错义突变、无义突变、移码突变、指环区突变及相应于BRCA1转录本数量减少/缺失的调整突变。在BRCA1全部突变类型中,以移码突变最为多见(占58%),86%的突变产生截短蛋白的产物。经证实BRCA 1基因缺失占致病性突变的40%。世界各地的遗传性乳腺癌均发现有大量BRCA1突变。大量研究表明,伴有BRCA 1变异基因携带者的家族中,乳腺癌的发病危险升高。伴有BRCA1变异基因携带者的女性一生中乳腺癌的发病风险较正常女性高43%84%。大约40%～50%的遗传性乳腺癌是由BRCA 1变异引起的。而在乳腺癌和卵巢癌都高发的家族中,80%的以上的患者发病与BRCA 1基因变异有关[20]。典型BRCA1相关家族的特点是:①家族中既有多名乳腺癌(至少3名),又有卵巢癌患者(至少1名),但没有男性乳腺癌患者;②癌症的发病年龄往往比较低,一般小于 45岁[21]。Col NF和 Chlebow ski RT[22]认为:任何一个有乳腺癌家族病史的妇女,都应评定为她是否有可能携带BRCA基因突变,并且应接受遗传咨询和可行的遗传测试。在家族性乳腺癌中,BRCA 1等位基因异常,直接影响基因组的稳定性,使细胞对环境变化的敏感性增加,同时损伤修复功能降低,由此导致多种突变包括原癌基因突变在细胞内累积,最终发生恶性转化。

5 BRCA1突变与三阴性乳腺癌

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性表达的乳腺癌。目前认为三阴性乳腺癌预后较差,淋巴结转移也较多,这类乳腺癌具有相似的特征、极高的同源性,组织分化往往较差,多属于基底样(basal-like)乳腺癌,与BRCA 1相关性乳腺癌具有许多相似性。两者不仅预后均较差,而且还有相似的分子特征:核分级高,ER阴性,K i-67、CK 5/6、EGFR阳性,常表达c-MYC且p53常发生突变,基因表达分析显示两者还有相同的发病途径、遗传性改变[23]。

6 BRCA1变异携带者的治疗

在现阶段,家族性乳腺癌患者在药物治疗上的选择与散发性乳腺癌并没有区别。BRCA 1变异携带者中,三阴性乳腺癌及髓样癌的发现比例越来越高[23-24]。而对于三阴性乳腺癌及髓样癌病人,主要采用的是基于化疗的辅助治疗手段,(而不是基于内分泌治疗或曲妥珠单抗)。BRCA1变异的乳腺癌小鼠模型的建立,为以顺铂为基础的治疗提供了强有力的支持[25]。BRCA 1变异的细胞株对顺铂治疗更敏感,而对紫杉醇更加耐药,相反的,BRCA 1未发生变异的细胞株对顺铂更耐药,而对于紫杉醇治疗更加敏感[26]。

Leunen,K等[27]回顾性分析了67名接受了预防性乳房切除术的病人,这些病人中的15%是BRCA 1基因变异携带者。67名病人中的22%术后病理提示浸润性癌或者上皮内瘤变,而术前的影像学和临床检查均未发现这些病变。1995年8月至2006年10月马尔默大学医院连续观察100名有更高乳腺癌遗传风险的妇女,并对其行预防性乳房切除术。其中的50例之前没有患过乳腺癌,有50名BRCA1或BRCA2基因突变携带者。术后病理提示:在这100例病例中,发现了18例异常病变,包括3例浸润性癌,8例原位癌,7例不典型增生。这项研究还发现,BRCA基因突变携带者与没有BRCA基因变异的患者比较,更有可能呈现不典型导管增生及不典型小叶增生[28]。基于BRCA基因变异携带者的高乳腺癌发病风险和上述预防性乳腺切除的病理学发现,针对她们的预防性乳腺或卵巢切除也许是个值得考虑的治疗措施。

7 近期研究热点

雌激素是乳房发育的初始动力,并且黄体酮也参与到乳房发育过程中,但是这些激素都需要乳腺中的生长激素(Grow th hormone)诱导的胰岛素样生长因子1(insulin-like grow th factor-I)才能发挥作用。胰岛素样生长因子1或者生长激素在乳腺中的作用被抑制之后,雌激素和孕激素因此被阻止发挥作用,最终在乳腺癌的化学预防中起到了重要的作用,而这种作用尤其是对BRCA1变异的女性乳腺癌患者明显[29]。

Amy Berrington de Gonzalez等[30]评估乳腺X线摄影与乳腺癌风险的研究表明:常规乳腺X线筛查会带来辐射增加,从而导致乳腺癌发病率、死亡率增高;同时,早期筛查、早期诊断也会导致死亡率下降。两者相比较而言,对于年龄不到34岁的接受乳腺X线摄影筛查的BRCA 1变异的妇女,接受乳腺X线摄影检查所带来的乳腺癌死亡率的降低的获益并没有比其可能诱导的乳腺癌发病率、死亡率的增高大很多。而对于超过35岁的妇女,则发现可以有明显的获益。

Ginsburg O等[31]发现:正在吸烟的BRCA1或BRCA 2变异携带者患乳腺癌的风险与不吸烟的人比较,并没有增加。而过去有吸烟史的BRCA基因变异携带者患乳腺癌的风险明显增加。

随着乳腺癌发病率的增加,乳腺癌易感基因的研究越来越被重视。通过对易感基因的研究来全面阐明乳腺癌发生的遗传机制,对乳腺癌患者危险性的准确评估,早期发现以及有效的治疗和预防提供理论基础,尤其是那些有家族史和有易感基因突变携带者、有癌症易患因素者等的临床应用都有很重要的意义。但目前对BRCA 1的功能还所知甚少,仍有许多问题尚须深入研究,如BRCA 1的抑癌机制,BRCA1与新辅助化疗有效性的关系,简化BRCA 1基因突变检测技术,将其纳入乳腺癌高危人群普查项目之一。以及怎样对基因突变携带者进行有效的预防,乳腺预防性切除对于BRCA 1突变携带者带来的长期获益价值的评估等。

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