骨关节炎软骨细胞凋亡研究进展*

三峡大学第一临床医学院骨科(宜昌 443002)严雪港 综述 鲍同柱 审校

随着社会人口老龄化 ,骨关节炎(Osteoarthritis,OA)发病率越来越高,已成为50岁以上男性无法参加工作的第二位原因,仅次于缺血性心脏病[1]。O A的主要病理特征为关节软骨细胞凋亡和细胞外基质的进行性降解,以往研究大多侧重于基质酶性降解和 /或合成新的基质受到抑制而导致软骨的破坏,很少注重软骨细胞生存或死亡在O A关节软骨降解过程中所起的作用。近年来研究显示,正常的软骨细胞是维持细胞外基质稳定的必要条件,细胞凋亡是OA关节软骨退变的关键因素[2]。现就软骨细胞凋亡与O A的关系作一综述。

1 细胞凋亡 1965年,澳大利亚科学家发现结扎鼠门静脉后,电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞,这些细胞体积收缩、染色质凝集 ,但溶酶体并未被破坏,不同于细胞坏死。1972年,Kerr等[3]首先提出了细胞凋亡(Apoptosis)的概念,其主要特点是细胞核特征性裂解,但细胞器保持完整 ,因细胞死亡过程中无内容物的暴露,所以几乎不导致炎症反应。细胞凋亡是一种由基因控制的、主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程,与生长、发育以及内环境稳定密切相关。然而,异常凋亡则是病理性和有害的 ,肿瘤、Alzheimer's病、获得性免疫缺陷综合征等多种疾病均与细胞的异常凋亡有关。

2 OA软骨细胞凋亡及特点 Hashimoto[4]用流式细胞技术检测到 OA软骨细胞22.3%发生凋亡,而正常软骨细胞为4.8%。 Heraud等[5]采用荧光激活细胞分类法(FACS)、原位杂交及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)等方法观察人正常和 OA股骨头关节软骨,发现 OA患者中有 18%～ 21%软骨细胞表现出凋亡特征,而正常关节软骨中只有2%～5%凋亡细胞。国内学者秦泗通等[6]通过对大鼠行单侧膝关节前交叉韧带切除术(ACL T)造模后与正常组比较,凋亡指数分别为(11.31±1.34)%和(1.48±0.38)%。综上所述,尽管软骨细胞的凋亡比例各家报道略有差别(差异可能与检测方法或实验对象不同有关),但均证实了O A关节软骨细胞的凋亡高于正常关节软骨细胞。

与一般细胞凋亡相比,OA软骨细胞凋亡有其独特性:①将关节软骨基质泡分离出来连同正常的软骨细胞以及软骨细胞诱生的凋亡小体进行三磷酸核苷酸磷酸脱氢酶(N TPPH)的活性检测,发现N TPPH在软骨细胞间隙内或软骨基质间凋亡小体内的活性明显升高,由于 NTPPH与钙化沉积和骨的钙化有关,因此凋亡小体可能有加速关节软骨钙化的功能[7];②由于关节软骨中无血管分布,当软骨细胞发生凋亡时,凋亡小体无法被巨噬细胞带走而滞留在关节软骨内,影响关节软骨正常生理功能,只有当软骨基质发生降解,凋亡小体才有可能被释放到关节间隙中而被清除;③软骨细胞凋亡与基质降解密切相关[8],当关节软骨细胞过度凋亡时,由软骨细胞合成的基质减少,破坏其生存环境,形成恶性循环。上述特点阐明了软骨细胞凋亡在O A的发生发展中起着至关重要的作用。

3 关节软骨细胞凋亡途径 Hashimoto[9]研究发现,OA软骨细胞凋亡由NO和 Fas两种途径介导,因NO合成的抑制剂不能抑制 Fas途径诱导的凋亡,两者相互独立。

3.1 NO途径:一氧化氮(Nitric oxide,NO)是 80年代被发现的一种具有高度反应性、细胞毒性、弥散性物质,对细菌、真菌和肿瘤细胞及正常组织均能产生杀伤作用的无机小分子,广泛存在于生物体内。 Kaur等[10]证实NO对风湿性关节炎患者的关节损伤通过两种途径起作用:其一为高浓度的 NO能抑制多种与线粒体电荷传递系统及柠檬酸循环有关的酶;其二为NO与超氧化阴离子O2-反应生成过氧化亚硝基阴离子ONOO-,在一定条件下分解为有很强毒性的OH-和NO-自由基。OA是由一系列生物与力学因素引起的退行性疾病,其软骨细胞能产生 IL-1、TNF-α、前列腺素和NO等大量炎性调节因子[11]。Wu等[12]和 Maneiro等[13]研究发现,无论是内源性的或外源性NO,均能通过线粒体途径诱导软骨细胞调亡,将人软骨细胞通过NO外源性供体硝普钠(SNP)或内源性供体磷酸脂多糖(LPS)和干扰素(INF)-γ、NO、活性氧(ROS)、细胞色素 C干预后,均导致 Caspases-3活性升高和DN A裂解,用NO合酶抑制剂L-单甲基精氨酸治疗O A则能降低NO及其它细胞凋亡标志物的表达,有力地证明了 NO可诱导 OA软骨细胞凋亡。

3.2 Fas途径:Fas是位于细胞膜上Ⅰ型跨膜糖蛋白,又称 Apo-1或 CD95,属 TN F/NGF受体家族成员 ,是一条公认的凋亡信号传导通路,许多细胞表达 Fas,人类 Fas基因位于第 10号染色体,FasL是Ⅱ型膜蛋白,属肿瘤坏死因子家族成员,仅在激活的 T淋巴细胞表达,位于第 1号染色体。当 Fas与Fas-L结合后,诱导酪氨酸和苏 /丝氨酸发生磷酸化反应,引起细胞内Ca2+浓度升高,从而活化 Caspase,引起 DN A降解,导致靶细胞凋亡[14]。正常人的软骨几乎看不到凋亡细胞,而在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区,Fas表达的结果与其相符,OA受损区的 Fas表达远高于未受损区[15],提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。Kim等[16]发现鸟苷能增强Fas-Fasl的相互作用,从而诱导软骨细胞凋亡,进一步佐证了 Fas途径与软骨细胞凋亡有关。 Hashimoto[9]等研究发现,Fas可在软骨细胞表达,Fas-L主要由滑膜中激活的 T细胞产生,而软骨细胞不能表达,因此 Fas途径是与滑膜炎症相关的细胞凋亡途径。

4 OA关节软骨细胞凋亡相关原癌基因的表达 软骨细胞的存活依赖于癌基因之间的平衡,Bcl-2基因家族、P53基因、ICE基因家族、c-myc基因等均可调控软骨细胞凋亡途径,其中 Bcl-2基因家族和P53基因研究较为深入。

4.1 Bcl-2基因家族:Bcl-2基因是 1984年由 Tsujimto等在滤泡性淋巴瘤细胞中染色体易位 t(14:18)的断点上发现的一种原癌基因,位于18号染色体短臂,Bax基因是Bcl-2基因家族的最主要的促凋亡基因,定位于11号染色体。该基因家族通过以下途径来调控细胞凋亡[17]:① Bax和 Bcl-2、Bcl-X1可形成脂质双分子层通道,Bax促进线粒体通透性转换孔(PTP)开放,形成正反馈扩大过程,导致线粒体结构和功能的紊乱 ,线粒体外基质内流,渗透压失衡,细胞器肿胀,线粒体的内、外膜依次裂解,释放出Caspase,激活蛋白 ,诱导细胞凋亡,而Bcl-2、Bcl-X1抑制 PTP开放,阻止细胞凋亡;② Bcl-2直接或间接阻止细胞色素 C(CytC)从线粒体释放,抑制细胞凋亡;③Bax同源二聚体能诱导细胞凋亡,随着 Bcl-2蛋白表达量上升,越来越多的Bax二聚体分开,与 Bcl-2形成比 Bax-Bax更稳定的 Bax-Bcl-2异源二聚体,从而“中和”了 Bax-Bax诱导细胞凋亡的作用;④定位于内质网膜上的 Bcl-2可能通过阻断Ca2+从内质网向胞质中的流动,使依赖 Ca2+的核酸内切酶活性降低,从而阻断细胞凋亡;⑤Bcl-2通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能。Hashimoto[5]认为 OA患者软骨细胞中BaxmRNA的升高是关节软骨细胞凋亡的重要因素,而 Bcl-2mRNA表达的升高,则是机体保护软骨细胞免遭凋亡的体现。国内学者马春辉[18]对原发性 OA、继发性OA和正常关节软骨通过逆转录 /聚合酶链反应(RT-PCR)检测 Bax/Bcl-2 mRNA,发现原发性 OA中 BaxmRN A和 Bcl-2mRN A均升高,而继发性 OA中只有 Bcl-2mRN A升高,结果与Hashimoto的观点一致。

4.2 P53基因:P53基因于 1979发现,人类 P53基因定位于17号染色体短臂(17P13.1),由11个外显子和10个内含子组成,编码分子量为 53-kDa的核内磷酸化蛋白,以转录因子的形式控制细胞增殖与 DN A修复[19]。 P53通过感知细胞 DN A损伤,靶基因编码产物 P21可以促使细胞停留在 G1期,进行 DNA损伤修复,一旦这种修复无法完成,P53将促进一系列凋亡相关蛋白的表达 ,例如 Bax、 PUMA、Noxa、Fas、P53调控的凋亡诱导蛋白 1(P53-regulatedapoptosisinducingprotein1,P53AIP1),从而有效的诱导细胞凋亡[20]。 Okazaki等[21]检测兔 P53mRNA水平、TUN EL检测凋亡细胞数量,发现兔膝 OA组中明显高于正常组,从而提示 P53在关节软骨细胞凋亡中发挥了重要作用。有证据显示[19],P53基因能分别诱导 Bax基因表达,抑制Bcl-2基因表达,提示 P53基因与 Bcl-2基因家族在调控细胞凋亡时具有协同作用。

5 结 语 软骨细胞凋亡途径受到包括 Bcl-2基因家族和 P53基因在内的许多因素调控,通过对凋亡过程中胞内信号转导途径与级联反应中关键步骤的研究深入,利用药物切断其信号传导途径抑制软骨细胞凋亡,已成为目前研究重点。

[1]邱贵兴.骨关节炎流行病学和病因学新进展 [J].继续医学教育,2005,19(7):68-69.

[2]Kim HA,BlancoFJ.Cell death and apoptosis in osteoarthritis[J].Curr Drug Targets,2007,8(2):333-345.

[3]Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26(4):239-257.

[4]Hashimoto S,Ochs RL,Komiya S,et al.Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilagedegradation in human osteoarthritis[J].Arthritis Rheum,1998,41(9):1632-1638.

[5]H é raud F,H é raud A,Harmand M F.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J].Ann Rheum Dis,2000,59(12):959-965.

[6]秦泗通,蒋 青,黄际河,等.p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂对大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的影响[J].山东医药,2008,48(6):6-8.

[7]Hashimoto S,Ochs RL,Rosen F,et al.Chondrocytederived apoptotic bodies and calcification of articular cartilage[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(6):3094-3099.

[8]ThomasCM, FullerCJ,Whittles CE,etal.Chondrocyte death by apoptosisis associated with cartilage matrix degradation [J]. Osteoarthritis Cartilage,2007,15(1):27-34.

[9]Hashimoto S,Setareh M,Ochs RL,et al.Fas/Fas ligand expression and induction of apoptosis in chondrocytes[J]. Arthritis Rheum,1997,40(10):1749-1755.

[10]KaurH,Halliwell B.Evidence fornitric oxidemediated oxidativedamage in chronic inflammation.Nitrotyrosine in serum and synovial fluid from rheumatoid patients[J].FEBS Lett.1994,350(1):9-12.

[11]Abramson SB,Attur M,Yazici Y.Prospects for disease modification in osteoarthritis[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2006,2(6):304-312.

[12]Wu GJ,Chen TG,Chang HC,et al.Nitric oxide from both exogenous and endogenous sources activates mitochondria-dependent events and induces insults to human chondrocytes[J].J Cell Biochem,2007,101(6):1520-1531.

[13]Maneiro E,L ó pez-Armada M J,de Andres M C,et al.Effect ofnitric oxide on mitochondrial respiratory activity of human articular chondrocytes[J].Ann Rheum Dis,2005,64(3):388-395.

[14]Cahuzac N,Baum W,Kirkin V,et al.Fas ligand is localized to membrane rafts,where it displays increased cell death-inducing activity[J].Blood,2006,107(6):2384-2391.

[15]Kim HA,Lee YJ,SeongSC,et al.Apoptotic chondrocyte death in human osteoarthritis[J]. J Rheumatol,2000,27(2):455-462.

[16]Kim DJ,Chung JH,Ryu EK et al.Metabolic loading of guanosine induces chondrocyte apoptosis via the Fas pathway[J].Exp Mol Med,2006,38(4):401-407.

[17]周 桔,罗荣保,汤长发 ,等.Bcl-2蛋白家族和p53基因在细胞凋亡中的调控效应[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(10):1950-1952.

[18]马春辉,阎作勤,郭常安,等.凋亡相关基因 Bax和 bcl-2在骨关节炎软骨中的作用 [J].中国关节外科杂志(电子版),2007,1(4):232-237.

[19]Miyashita T,Reed JC.Tumor suppressor P53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene[J].Cell.1995,80(2):293-299.

[20]Meek DW.The P53 response to DN A damage[J].DNA Repair(Amst),2004,3(8-9):1049-1056.

[21]Okazaki R,Sakai A,Ootsuyama A,et al.Apoptosis and p53 expression in chondrocytes relate to degeneration in articular cartilage of immobilized knee joints.J Rheumatol,2003,30(3):559-566.