TIG2在原发性肝癌中的表达及意义

西安交通大学第一附属医院肝胆科(西安710061)

于照祥△ 陈颖慧* 刘青光

众所周知,维 A酸是通过其核内受体来完成其生物学功能的,其核内受体分为二类,即维 A酸受体和异维 A酸受体。他扎罗汀作为一类合成的维 A酸受体β/γ选择性炔类维 A酸,可诱导产生他扎罗汀诱导基因(Tazarotene-induced gene,TIG)1,2和3[1]。TIG2又名chemerin,是 chemR23的天 然配 体[2],由 前体prochemerin经蛋白酶水解后生成,chemerin与其受体结合后可趋化树突状细胞和T细胞,一系列生理病理反应,研究表明,chemerin也可联系内外免疫反应。同时,TIG2可以诱导细胞产生 IL-8,IL-18的释放,从而趋化抗原呈递细胞到目的部位,调节免疫反应并促使细胞释放更多的细胞因子和趋化因子,从而并达到抗炎和免疫监视和免疫防御的功效。因此,本实验检测TIG2在正常肝组织及肝癌中的表达。

材料和方法

1 材 料 兔抗人 chemerin/TIG2单克隆抗体购于美国 Phoenix pharmaceuticals(Catalog No.G-002-52),此浓度稀释100倍。二抗为羊抗兔IgG-HRP.原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物公司,TIG2的探针序列:5’-TTCACAAGCACCCGCCCGTGCAGTG GGCCTTCCAG-3’.5’地高辛标记,与人类其他基因无同源性收集临床和病理确诊的原发性肝癌蜡块 30例,女14例;年龄 45～70岁,平均 56.5岁),未受累组织距肿瘤组织 3cm。19例正常组织中男11例,女8例,年龄55.4岁。此两组年龄、性别无显著差异性。原发性肝癌分期:Ⅰ期:未分化细胞数＜25%;Ⅱ期:未分化细胞数＞25%而＜50%;Ⅲ期:未分化细胞数＞50%而＜75%。

2 方 法

2.1 免疫组化定位检测:新鲜组织常规固定和包埋。

2.2 KAI1免疫组化染色:已制备好的肿瘤组织切片,56℃烤片过夜,经过二甲苯Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ各 10min,无水乙醇、95%、85%、75%乙醇梯度水化各 2 min处理,流水冲洗 2～3 min,3%甲醇过氧化氢室温下避光孵育30 min,蒸馏水洗 2min×3次,0.01 M PBS浸泡 5 min×3次,切片用 0.01 M柠檬酸钠缓冲液,预热,微波(100℃)抗原修复 10 min,自然冷却,0.01 M PBS洗5min×3次,10%正常羊血清工作液,37℃封闭 20 min,倾去,不洗,滤纸吸去封闭剂,加兔抗小鼠 TIG2亲和纯化抗体(Ⅰ 抗),0.01 M PBS洗 5min×3次,加羊抗兔生物素化二抗(即用型),37℃湿盒中孵育 30 min,0.01 M PBS洗 5min×3次,加 HRP标记的链亲和素(即用型),0.01 M PBS洗 5 min×3次,37℃湿盒中孵育 30min,0.01 M PBS洗 5 min×3次,DAB显色,显微镜下观察,适时终止,自来水冲洗,苏木精轻微复染 1～2min自来水冲洗,75%、85%、95% 无水乙醇梯度脱水各 2min,二甲苯Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ各 2min透明,中性树脂封片,光镜观察阴性对照:用 PBS液代替一抗,确定有无特异性结合。

2.3 同法、同步骤处理未转染的阴性对照组。

2.4 免疫组化染色结果的判断标准:采用半定量积分法,即对每张切片的阳性细胞数及阳性细胞着色强度分别进行分级计分,然后根据两项之和确定其阳性强度。阳性细胞率即阳性细胞占计数细胞的比例,每张切片以计数 10个40×10倍视野细胞为准进行观察,根据切片上细胞着色比例的不同分别出示为:无阳性细胞或仅有 10%观察细胞着色,计为0分;阳性细胞数 10%～25%,计为1分;阳性细胞数 25%～50%,计为2分;阳性细胞数50%～70%,计为3分;阳性细胞数70%～100%,计为4分;再结合染色强度,无着色细胞为(-),计为0分;浅黄色为(+),计为1分;棕黄色为(++),计为2分;棕褐色为(+++),计为3分;无颗粒沉积或仅出现片状或均匀黄染者可能是DAB沉积,而非真正的阳性染色,应视为阴性。两项之和0分为无表达,1～3分为低表达,4～7分为高表达。

结 果

TIG基因在正常肝组织中呈高表达,而在原发性肝癌中呈低表达,且随着细胞分化程度的降低,TIG基因的表达量也随之明显降低。

讨 论

研究表明,TIG2 mRNA见于皮肤,肝脏,胰腺,卵巢和大小肠中,其蛋白可见于卵巢癌,淋巴器官和红斑狼疮的真皮血管内皮细胞中,而成熟 chemerin则存在于多种炎症液和血液滤液中。catelicidin家族的chemerin可以趋化未成熟的树突状细胞和巨噬细胞,此两种细胞是chemR23受体的主要表达部位。许多类型的肿瘤细胞可直接通过趋化树突状细胞和巨噬细胞,而肿瘤中这些细胞的增生和侵润。TIG2在抗肿瘤方面的作用逐渐受到越来越多的重视。现已发现,TIG2在皮肤癌,非小细胞肺癌中均表达降低,且与肿瘤的分化程度及病理分期关系密切。作者假设,肿瘤起始阶段,不良刺激是非活化的prochemerin在蛋白水解酶的作用下,分泌出成熟chemerin,其可趋化抗原呈递细胞(APC)的聚集,导致特异性免疫以对抗肿瘤。

综上所述,TIG基因在正常肝组织中呈高表达,而在原发性肝癌中呈低表达,且随着细胞分化程度的降低,TIG基因的表达量也随之明显降低;同时,TIG可以诱导细胞产生 IL-18,IL-8等炎症因子的释放,从而趋化 APC到目的部位,调节免疫反应并促使细胞释放更多的细胞因子和趋化因子,从而达到抗炎和免疫监视和免疫防御的功效。

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