胡伊乐,曹 靖,徐玉英,臧卫东,涂心明
疼痛是在人体受到各种伤害性刺激时所产生的感觉。是存在于人体内部的警戒与保护系统, 对机体有重要的生物学意义, 它能引起机体产生被动性防御反应以躲避伤害刺激, 对机体具有保护作用。但是过度的伤害性刺激不但会引起强烈的疼痛感觉而且还会导致机体生理功能的紊乱, 甚至休克[1-3]。痛觉种类很多, 可以分为皮肤痛、内脏痛和来自肌肉、肌腱和关节的深部痛。通常当痛觉达到一定程度时,可伴有机体某种生理变化以及不愉快的情绪精神反应。 疼痛伴随与许多疾病和创伤, 特别是慢性顽固性疼痛和晚期癌痛, 不仅给患者自身带来躯体和精神上的痛苦, 同时也给家庭和社会带来沉重的负担。
慢性疼痛通常分为中枢性疼痛、组织损伤刺激、心理性疼痛、行为性疼痛4种。中枢性疼痛是由于中枢神经系统病变导致的疼痛, 多由于传入神经损伤, 中枢疼痛病人常感到异常的疼痛。组织损伤刺激是慢性疼痛中最常见的一种, 包括癌症、肌筋膜炎综合症、慢性退行性关节炎等疾病。在慢性疼痛状态下损伤组织刺激为一重要因素。心理性疼痛较为少见, 它一般没有机体组织的损伤或病理改变, 完全是由于抑郁和悲观失望或社会因素的影响, 引起心理性或者精神性疼痛, 少数患者可能有轻微的组织损伤或非组织损伤的信息,但被敏感的心理状态予以增强, 就表现出心理性疼痛。行为性疼痛更为少见, 仅见于中年人群, 其疼痛形式表现特殊,常由行为表现疼痛, 因个体差异行为性疼痛表现亦不同,严重者无法从事社会活动和工作。慢性疼痛常合并表现出精神抑郁、悲观等情绪, 病人不仅有实质性组织损伤同时还伴有严重的心理障碍, 因此, 在治疗慢性疼痛时不能单纯治疗组织损伤,必须同时合并心理支持和抗抑郁治疗, 只有这样才可以有效地减轻患者疼痛感觉,恢复正常功能。
目前治疗疼痛的方法有多种, 针灸、按摩是传统中医治疗疼痛的方法,切割与痛觉有关神经通路的外科手术以及暗示、催眠、安慰剂等生理学方法镇痛也有较好的治疗效果。目前临床应用最多的镇痛方式为药物镇痛, 常用的镇痛药物包括以下几类非甾体类药、抗抑郁类药、抗惊厥类药、阿片类镇痛药物。其中以阿片类镇痛药物效果最好, 但其长期应用时常导致过度镇静、呼吸抑制、头晕、恶心、呕吐、瞳孔缩小、皮肤瘙痒、便秘、尿潴留、出汗、认知功能减退等毒、副反应及对药物产生依赖性、成瘾性及耐受性等, 从而大大限制了其在临床上的应用。因此,寻找一种安全有效、经济方便、作用持久的镇痛方法已成为人们感兴趣的科研课题。
伴随分子生物学技术在20世纪80 年代以后的快速发展,生命科学研究的许多领域都因此项技术的应用发生了质的飞跃。分子生物学研究中,基因克隆、测序、基因表达及改变基因表达等方法日臻成熟, 为转基因技术的产生奠定了基础,也为疼痛的转基因治疗开启了新时代[7]。疼痛的转基因治疗包括以下几方面内容:①镇痛基因的选择;②镇痛基因的扩增、测序;③镇痛基因转移传递系统的选择;④镇痛基因靶组织的选择;⑤镇痛目的基因表达的调控;⑥试验疗效及安全性评价等。慢性疼痛基因治疗的研究目前才刚刚起步,很多技术尚未成熟, 各种基因治疗方法还处于探索阶段。 慢性疼痛基因治疗的研究的重点目前还只是集中在镇痛基因的选择、传递以及靶组织的选择3方面[8]。
3.1 疼痛基因治疗的可行性基因治疗是在分子生物学、细胞生物学、病毒学的基础上建立起来的一项新技术, 利用该技术可将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因, 通过一定方式转入人体靶细胞内表达,以纠正基因缺陷或发挥治疗作用, 从而达到治疗疾病的目的。疼痛的基因治疗是将一些抗痛基因、调控因子基因或受体基因等相关外源基因插入载体中, 加上启动子后导入靶组织细胞, 使其在靶细胞内表达[9,10],通过增加机体内抗痛基因的表达而达到镇痛的目的。疼痛的转基因治疗避免了传统用药时所产生的不良反应, 在疼痛治疗领域具有较好的应用前景。
3.2 基因治疗的方法[11,12]目前基因治疗中常用的有基因置换、基因修复、基因修饰、基因失活、免疫调节等几种, 基因置换是以正常的基因导入基因突变的细胞, 原位替换病变细胞内的致病基因, 从而实现细胞内的DNA完全恢复正常状态。这是一种理想的治疗方法,但由于目前各种试验技术的限制难以达到。基因修复也称原位修复,它是参照野生型基因的结构, 对突变的基因进行修复, 使突变的基因恢复正常,从而得到正常的细胞表达。 这也是一种理想而直接的基因疗法, 但在目前的技术条件下也很难达到。基因修饰是将需要的目的基因导入机体内的病变细胞或其他细胞, 导入的目的基因所表达的产物能够使原有的一些功能得到加强或弥补缺陷细胞的功能。此方法是目前基因治疗中应用最多的一种方法。基因失活是利用反义RNA、核酸或肽核酸等反义技术以及RNA干涉技术等方法, 特异性地封闭机体内某种基因, 从而抑制一些有害基因的表达, 以达到治疗疾病的目的。临床上常见此方法应用于恶性肿瘤的治疗。免疫调节是将表达抗原、抗体或细胞因子的基因导入病人体内, 通过改变病人免疫状态, 达到预防和治疗疾病的目的。 此法常用于恶性肿瘤和感染性疾病的防治。
3.3 疼痛治疗中镇痛基因的选择3.3.1内源性阿片肽 内源性阿片肽(endogenous opioid peptides)分为脑啡肽、内吗啡肽、孤啡肽、强啡肽和β -内啡肽5大类, 是哺乳动物体内天然生成的具有阿片样作用的肽类物质的总称。其主要作用就是通过与机体内阿片类受体结合参与疼痛信息的调控, 抑制痛信息的传递, 从而发挥镇痛效应[13]。不同的内源性阿片肽具有不同结构特点的氨基酸序列, 在人体内有广泛的分布和多种生物学效应。它们在机体内的功能与阿片类药物的功能相似,首先它们都具有较强的镇痛功能, 脑啡肽、强啡肽、β -内啡肽以及最近发现的内吗啡肽均有明显的镇痛作用;机体内的μ、δ和κ阿片受体都参与痛觉调制, 目前阿片家族3个阿片肽前体(前脑啡肽、前强啡肽、前阿黑皮素);3 个阿片受体即μ受体、δ受体、κ受体的基因已经被成功克隆[14,15]。
3.3.2细胞因子 细胞因子包括神经营养因子与免疫调节性细胞因子,神经营养因子是一类特殊蛋白分子, 它能够促进特定神经组织细胞分化和再生, 并刺激神经递质释放及改变神经元特性[16,17],常见的有脑源性神经营养因子(BDNF)、NT-4、神经营养蛋白(NT)-3 和神经生长因子(NGF)等[18-20]。常用于神经损伤或中毒导致的慢性神经痛的治疗,主要机制是通过抑制神经元凋亡和促进阿片肽释放治疗疼痛。用BDNF基因治疗神经痛目前已有成功的实验报道。免疫调节性细胞因子,常见的有(IL)-10和白介素(IL)-2。前者通过抑制神经组织炎症反应达到镇痛目的, 后者通过类阿片肽作用缓解疼痛。其中IL-2基因治疗是由中国科学院生化所刘新坦研究组于 2002 年完成, 是国内最早真正意义的疼痛基因治疗研究。
3.3.3RNAi 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种特殊生物学现象,是由双链RNA(dsRNA)介导的特定酶参与的特异性基因沉默现象,它通过一种小片段干扰性双链RNA作为效应分子[21,22], 催化与靶基因mRNA结合的级联反应而减少的mRNA含量, RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。实际上就是通过细胞内的聚合酶链反应大量扩增干扰性RNA, 干扰目的基因的表达, 此项技术在植物及非脊椎动物如线虫、果蝇中的研究中已经取得了很多重要的成果, 但在哺乳动物中的研究还处于起步阶段,目前报道较少。
3.4 疼痛转基因治疗中载体的选择在基因治疗过程中使用载体有两个目的:一是用它作为运载工具, 将镇痛基因转移到宿主细胞中然后在宿主体内表达;二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。目前广泛使用的基因转移系统主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
3.4.1病毒载体系统 病毒载体是指用感染性的病毒作为人或者其他哺乳动物核苷酸的传递系统。它是没有细胞结构的最简单、最小的生命寄生体。根据病毒能高效率地进入特定的细胞类型, 表达自身蛋白并产生新的病毒粒子的特性,将病毒用包裹细胞包裹, 形成病毒颗粒, 然后感染宿主细胞并随机整合进入宿主基因,释放治疗基因。目前科研中常用的有逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体 5种载体类型。由于存在自身免疫原性和(或)造成细胞病理改变等缺点, 病毒型载体系统目前逐渐被低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低的非病毒载体所替代。
3.4.2非病毒载体[23]基因治疗载体应具备易进入细胞、稳定性、安全性、易制备和靶向性等特点。 非病毒载体以其使用简单、制备方便、外源基因整合几率低、无基因插入片段大小限制以及低毒、低免疫反应、便于保存和检验等优势受到广泛关注,越来越多的实验室选择非病毒载体基因转移系统作为研究方向。在疼痛的基因治疗中理想的非病毒载体需要满足以下条件:能有效将有活性的基因插入目的区;保护DNA在进入核前不被细胞内溶酶体和酶等降解;保护DNA不被细胞外DNA降解酶降解;携带DNA穿透细胞膜;可生物降解, 从细胞中消除;无细胞毒性等。常用的非病毒载体包括细胞载体、脂质体、裸DNA及真核表达载体。
3.5 基因治疗疗效观察为了观察疼痛基因治疗的效果,需要制备慢性疼痛的动物模型,常用的慢性疼痛动物模型包括:①慢性神经痛模型,如捆扎坐骨神经根及脊神经根;②慢性炎性疼痛模型, 如用40%甲醛、辣椒素注射的关节炎模型;③慢性肿瘤疼痛模型。对疼痛模型动物痛觉变化常用的检测方法有痛阈检测和行为学检测。痛阈检测即检测冷热刺激、机械刺激时外周痛阈的变化;行为学检测就是观察动物的行为变化, 模拟人类疼痛时情绪和行为反应。
基因治疗由Anderson在20 世纪 80 年代初首先提出,1990年在美国成功进行了ADA(腺昔脱氨酶)缺陷患儿的人体基因治疗。慢性疼痛由于涉及到中枢调控机理及中枢神经元的结构重塑, 目前主要的治疗是靠给麻醉性镇痛剂和非甾体类抗炎药等, 但这些药物的耐药、成瘾和其他副作用也限制了其应用。在各种普通治疗手段及普通药物对顽固性疼痛越来越束手无策时,基因镇痛给我们提供了一个新的疼痛治疗方法。随着人们对基因治疗技术研究的深入, 以及逐步建立起安全有效的基因调控体系后, 慢性疼痛的基因治疗将可能成为一种安全和有效的治疗手段。
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