小剂量阿司匹林对老年冠心病患者血小板活化功能的影响

黄大海,孙福成

(卫生部北京医院心内科,北京 100730)

血小板活化水平增高是许多疾病,包括心肌梗死、卒中和不稳定型心绞痛的重要发病机制[1]。阿司匹林抗血小板聚集治疗目前已经成为冠心病和急性冠脉综合征(ACS)患者一级预防及二级治疗的基石[2]。小剂量阿司匹林在老年冠心病及 ACS患者中应用较广泛[3-4],但如何评价小剂量阿司匹林对于老年人血小板的聚集抑制效果,目前并不肯定。我们通过准确测定血小板活化标志物 GPⅡb/Ⅲa和CD62P水平,观察小剂量阿司匹林对于老年冠心病人血小板膜表面糖蛋白表达率的影响,研究小剂量阿司匹林对老年冠心病人血小板活化功能的抑制程度,以期为临床用药提供参考。

1 对象和方法

1.1 研究对象 根据 1979年世界卫生组织(WHO)关于冠心病的诊断和分型标准,选择自2004年 9月至 2008年 5月间在北京医院心内科及老年病房住院和门诊就诊的老年冠心病患者共 116例。男性 90例,女性 26例,年龄 65～90岁,均符合下列条件之一:①陈旧性心肌梗死病史者;②冠状动脉造影(CAG)明确冠心病诊断者(冠状动脉主要血管直径狭窄程度≥50%);③存在冠心病危险因素,有典型心绞痛症状并伴有心电图或心肌核素显像提示心肌供血不足或有急性心肌梗死的动态演变,伴有心肌酶谱的动态改变。除外条件:急性脑血管疾病(1月以内);深静脉血栓形成;感染性疾病;合并服用其他抗血小板聚集的药物(包括被证实含有抗血小板聚集作用的中药)、抗凝药品物或解热镇痛药物;严重肝、肾功能受损,包括(ALT＞80 u/L,TBil＞2.0 g/L,DBil＞0.8 g/L,Cr＞2.0 g/L);消化道或其他脏器活动性出血者;粒细胞或血小板减少者;恶性肿瘤患者。

116例老年患者按照阿司匹林(拜阿司匹林:德国拜耳制药,100 mg/片)服用剂量不同分为:①阿司匹林 50 mg组(简称 ASA50):单独服用阿司匹林(ASA)50 mg/d,服药 14 d以上。②阿司匹林100 mg组(简称 ASA100):单独服用 ASA100 mg/d,服药 14 d以上。③对照组:2周内未曾服用任何抗聚及抗凝药物的冠心病患者。各组患者的基本资料如表 1。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集及处理 取血时间为每日上午 6～8点。取血前 8 h禁止吸烟,空腹12 h。采血前使患者保持安静状态 15 min。采用美国 BD公司CTAD真空采血抗凝管取静脉血 5 m l,抗凝剂与血液比例为 1∶9。血标本室温下保存,2 h之内进行样本处理。

1.2.2 实验方法 (1)血小板预活化:所有样本用活化诱导剂:终浓度 10μmol/L ADP(二磷酸腺苷)和终浓度 500μmol/L AA(花生四烯酸)各30μl,与240μl样本轻轻混匀,置 37℃环境放置5min,双相激活血小板。(2)样本制备及固定:分别取 PAC-1 FITC、CD62PPE、CD61 PerCP各 10μl加入一塑料试管中混匀作为测定管;另取 PAC-1 FITC、MIgGPE、CD61 PerCP、RGDS(5 mg/ml)各 10 μl加入一塑料试管中混匀作为对照管,两管中分别加入经过上述5m in激活静脉抗凝血 5μl与试剂轻轻混匀、室温条件下避光作用 20min,立即加入预冷 2～8℃的1%多聚甲醛 1 ml并混匀,置 2～8℃冰箱内 2 h,24 h内在流式细胞仪上进行测定。

1.2.3 全血流式细胞仪三色分析法测定血小板活化率 在 Cell Quest软件环境中,按顺序放置对照管和试验管,将流式细胞仪的前向角散射(FSC)、侧向角散射(SSC)、三色荧光(FL1、FL3)的检测信号均设置为对数放大,通过设定恰当的 FSC阈值排除细胞碎片和背景干扰。在检测 GPIIb/IIIa时,以CD61 PerCP/SSC双参数设门,分别检测对照管和测定管中单个血小板的光散射及三色荧光强度,并分析 FIBR(PAC-1)和 CD62P阳性 CAP的百分率及平均荧光强度(MFI),以测定管与对照管 MFI的比值(RMFI)代表血小板表达活化分子标志物的相对含量。

表1 受试者一般临床资料的比较

1.3 统计学处理 测试完毕后用 Cell Quest软件分析数据,获得待测标本的血小板的荧光散点图,对其进行统计分析。结果可表示为特异性荧光抗体结合的阳性百分率和平均荧光强度(MFI)。计量资料用均数 ±标准差表示,组间资料分析采用单因素方差分析,组间均数间的比较采用最小显著差异 t检验(LSD-t检验),计数资料采用百分数表示,组间比较采用 χ2检验。采用 SPSS统计软件(10.0版本)进行统计处理。

2 结果

服用阿司匹林 50mg/d(ASA 50)组及 100mg/d(ASA 100组)2周以上的受试者与未服用阿司匹林的受试者(Control组)相比较,血小板膜表面糖蛋白PAC-1的阳性表达率在 ASA50组、ASA100组和对照组分别为(64.40±15.71)%,(57.22±15.82)%及(75.8±15.71)%,两种剂量阿司匹林均较对照组明显降低(P＜0.05)。CD62P的阳性表达率分别为(68.01±9.57)%,(60.44±9.30)%及(78.59±6.38)%,阿司匹林组均较对照组明显降低(P＜0.05)。A50组与 A100组两组间比较,PAC-1的阳性表达率为 (64.40±15.71)%与(57.22±15.82)%,两组间差异无统计学意义(P＞0.05);CD62P的阳性表达率为(68.01±9.57)%与(60.44±9.30)%,两组间差异亦无统计学意义(P＞0.05),见表 2。

表2 小剂量阿司匹林对血小板活化率的影响(±s,%)

表2 小剂量阿司匹林对血小板活化率的影响(±s,%)

注:与对照组比较,a P＜0.05,b P＜0.01

组别 例数 PAC-1 CD62P对照组 45 75.8±15.71 78.59±6.38 ASA 50 35 64.40±15.71a 68.01±9.57a ASA 100 36 57.22±15.82b 60.44±9.30b

3 讨论

关于阿司匹林抗血小板治疗的最佳剂量,目前仍存在争议。尤其在老年冠心病患者中,因为所引起的消化道及脑等部位出血的并发症发生率相对较高,阿司匹林在临床使用中顾虑相对较多[5]。一些随机试验结果表明,阿司匹林剂量在 50～1 500mg/d时都具有抗栓作用,即使每日服用 30mg仍能发挥确切的抗血小板作用[6]。在心血管疾病的预防治疗中,阿司匹林宜选用最小的有效剂量[7]。多数专家推荐阿司匹林作为常规预防用药的剂量在 75～150 mg/d,这是基于对众多临床试验汇总分析比较后的结果。同时阿司匹林的应用有抵抗现象[8-10],即阿司匹林不能充分抑制 TXA2合成,生化表现为尿液中 TXA2的代谢产物 11脱氢 TXB2增高,这些患者心肌梗死、脑卒中或心血管死亡的联合终点的危险性增加(OR值 1.8)。这是因为阿司匹林主要影响血小板黏附和聚集的中间过程,抑制血小板聚集的程度不强,且有较大的个体差异性。如何有效评价阿司匹林对于老年人血小板聚集的抑制程度,同时对临床安全用药提供帮助,避免相关并发症的发生,是目前老年冠心病临床治疗中的难点之一[11-12]。

目前评价阿司匹林对血小板的抑制作用主要采用体外血小板最大聚集率抑制实验[13]。但此实验主要是对血小板被抑制后的功能评价,是间接性的评价,而且只能反映对某一种单一激活剂的阻断作用,如花生四烯酸、ADP等。不能准确反映血小板被抑制后,自身结构所表现的与其功能相适应的一系列结构变化。在人体内,CAP的表达率很低,不能准确反映阿司匹林对血小板聚集功能的整体抑制程度。而阿司匹林对血小板黏附和聚集功能的抑制是全身性、潜在性的,不能直接测定。FCM作为一种高效、快速、多参数分析的先进技术,可以非常灵敏地检测到活化血小板膜表面糖蛋白分子的变化,并且可以准确测定血小板膜糖蛋白的表达率,从而可以精确判断血小板的功能状态[14-15]。故可以通过体外特异性的多活化途径激活血小板后,经 FCM仪测定活化后的血小板表面膜蛋白的表达率,直接显示阿司匹林对血小板功能的抑制作用。

本项研究结果显示:老年冠心病人连续服用阿司匹林 50～100mg/d两周以上,与未服用阿司匹林组相比较,经体外活化诱导剂双相激活后,血小板膜表面糖蛋白的表达率明显降低。表明经两种激活剂同时活化血小板,尽管活化强度很大,但是仍可以看到小剂量阿司匹林对于血小板活化功能的抑制作用。同时比较阿司匹林 50 mg/d与 100mg/d对血小板活化率的影响,阿司匹林 100 mg/d对血小板活化功能的抑制似更明显,但两组间的差异无统计学意义。本项研究结果表明:阿司匹林对老年人血小板黏附和聚集功能抑制程度的测定,可以经体外双相激活血小板后,运用 FCM仪准确测定血小板膜表面标志性糖蛋白表达的阳性率,从而判断老年冠心病人血小板受抑制的程度,从而为临床抗血小板聚集药物的应用提供参考。

[1] 陈纪林.冠心病抗血小板治疗的进展[J].中国循环杂志,2004,19(1):5-6.

[2] Antithrombotic Trialists′Collaboration.Collaborative meta-analysis of randomised trials of antip latelet therapy for prevention of death,myocardial infarction,and stroke in high risk patients[J].BMJ,2002,324(7329):71-86.

[3] 杨维维,唐海沁.阿司匹林在心血管疾病中的应用进展[J].中国临床保健杂志,2007,10(5):535-538.

[4] 孙武,岳永焕,孙彩艳.心内科门诊使用阿司匹林情况的调查[J].中国基层医药,2007,14(6):1022.

[5] 芮铭安,柏金喜,张哲永,等.小剂量阿司匹林肠溶片致上消化道出血危险因素分析[J].中国临床保健杂志,2008,11(3):255-257.

[6] The SALT Collaborate Group.Swedish Aspirin Low-dose Trial(SALT)of 75mg Aspirin as secondary prophylaxis after cerebrovascu lar ischemic events[J].Lancet,1991,338(8779):1345-1491.

[7] Patrono C,Coller B,FitzGerald GA,et al.Plaelet-active Drugs:The relationships Among Dose,Effectiveness,and Side Effect.The Seventh ACCPConference on Antithrombotic and Thrombolytic Therapy[J].Chest,2004,126supp l3:234-264.

[8] 韦建瑞,吴樱樱,张文超,等.流式细胞术预测冠心病患者阿司匹林抵抗的研究[J].中国基层医药,2008,15(8):1233-1234.

[9] Krasopoulos G,Brister SJ,Beattie WS,et al.Aspirin“resistance”and risk of cardiovascularmorbidity:systematic review andmeta-analysis[J].BMJ,2008,336(7637):195-198.

[10] 刘宏宇.阿司匹林抵抗[J].中国基层医药,2008,15(4):689.

[11] 杨维维,唐海沁,徐维平,等.阿司匹林不同剂量和给药方法的药动学和药效学研究[J].中国临床保健杂志,2007,10(6):607-610.

[12] 郝卫军,司全金,李小鹰.老年心血管疾病患者应用不同剂量阿司匹林抗血小板治疗的临床研究[J].中国临床保健杂志,2006,9(3):210-211.

[13] Michelson AD,Frelinger AL III,Furman MI.Current options in platelet function testing[J].Am J Cardiol,2006,98(10A):4-10.

[14] Michelson AD.Flow cytometry assessment of glycoprotein movements in Platelets[J].Platelets,1997,8(2):105-115.

[15] Abrams C,Shattil SJ.Immunological detection of activation platelets in clinical disorder[J].Thromb Haemost,1991,65(5):467-650.