纳米羟基磷灰石的制备及在生物医学上的应用研究进展

李宾杰,姚素梅,李淑莲,马远方＊

(1.河南大学医学院免疫研究所; 2.河南大学医学院分子医学研究所;3.河南大学特种功能材料教育部重点实验室,河南开封475004)

纳米羟基磷灰石的制备及在生物医学上的应用研究进展

李宾杰1,2,3,姚素梅2,李淑莲1,马远方1＊

(1.河南大学医学院免疫研究所; 2.河南大学医学院分子医学研究所;3.河南大学特种功能材料教育部重点实验室,河南开封475004)

综述了近年来有关纳米羟基磷灰石制备方法及其在生物医学领域的应用研究进展;着重介绍了溶胶-凝胶法、化学沉淀法、水热法、前躯体水解法、模板法、超声波法、机械化学法等制备方法,并简要总结了纳米羟基磷灰石在肿瘤治疗、药物载体以及齿科材料和人工骨等生物医学领域的应用进展.

纳米羟基磷灰石;制备;应用;研究进展

羟基磷灰石(HA)是人体和动物骨骼、牙齿的主要无机成分,分子式为Ca10(PO4)6(OH)2,骨质中的羟基磷灰石是一种长度为200～400 nm,直径为15～30 nm的针状纳米颗粒,其周围规则地排列着骨胶原纤维.人工合成纳米羟基磷灰石(nHA)作为生物陶瓷具有很多优异的性能,如:生物相容性、生物活性、生物降解性、骨传导性、非免疫原性,等等,这些性质使其在生物医学领域有着广泛的应用前景.因此,近年来探索nHA不同的制备方法成为科学家们研究的热点,但主要是湿化学法,即在液相体系中进行.

1 nHA的制备方法

1.1 溶胶-凝胶法

溶胶-凝胶法是将金属醇盐或无机盐经水解直接形成溶胶或经解凝形成溶胶,然后使溶质聚合凝胶化,再将凝胶干燥、焙烧去除有机成分,最后得到无机材料.其优点是在低黏度的液体状态下混合原料,实现原子或分子级的均质化.它能严格控制化学计量比、工艺简单、烧结温度低、产物粒径小且分布均匀.

Kuriakose等[1]在85℃时将p H 10.5的0.5 mol/L Ca(NO3)2·4H2O乙醇溶液以5 mL/min的滴加速度加入到5 mol/L(NH4)2HPO4水溶液中,同时在溶胶-凝胶里面加入Ca(OH)2溶液,保持体系p H值为10,快速搅拌反应4 h后,将产品放入到40℃烘箱中过夜,得到的凝胶依次在400℃、750℃、1 200℃烧结2 h后得到半径为1.3 nm的纳米晶.邢瑞敏等[2]以CaCl2和P2O5为原材料,按Ca/P=1.67(摩尔比)分别配置CaCl2和P2O5的乙醇溶液,然后把P2O5醇溶液缓缓滴加到CaCl2的醇溶液中并搅拌30 min,得到无色透明的溶胶,把所制AAO模板浸入该溶胶中60 min后取出,真空干燥24 h,将之放于马弗炉中缓慢升温至600℃,恒温5 h,自然冷却至室温,制备的羟基磷灰石纳米线直径约为50 nm、长度达20μm.

黄龙全[3]等将0.25 mol CaO研磨成细小粉末过300目筛,加入到450 mL蒸馏水中,充分搅拌.将0.15 mol的 H3PO4用50 mL蒸馏水稀释后用滴定管慢慢滴加到溶有CaO的烧杯中,边滴加边用磁力搅拌器搅拌,直到烧杯底部的CaO全部溶解,形成白色的 HA溶胶.抽吸过滤后分别用蒸馏水、无水乙醇对所得胶体洗涤3次,然后在温度≤90℃下烘干得到粉体,最后在890℃温度下煅烧2.5 h得到羟基磷灰石粉体,颗粒直径为30 nm.

1.2 化学沉淀法

化学沉淀法是把沉淀剂加入到盐溶液中,发生沉淀反应后,将沉淀洗涤干燥后,或经热处理得到纳米材料.其特点简单易行,但纯度低,颗粒半径大,适合制备氧化物.

张维丽等[4]根据 HAP中Ca/P摩尔比应接近1.67,用转速为300 r/min磁力搅拌充分搅拌一定体积的0.25 mol/L Ca(NO3)2·4H2O溶液,并缓慢滴加20%的氨水溶液,调节Ca(NO3)2·4H2O溶液的p H值;当p H值达到10～11时,开始滴加0.15 mol/L(N H4)2HPO4溶液,得到白色沉淀,在反应过程中不断滴加氨水溶液,保持溶液的p H值不变,滴加完毕后,连续搅拌2 h.反应完毕后,在常温常压下陈化处理5 h以上,将陈化后的沉淀加入去离子水中,稀释并反复洗涤、离心,至反应产物接近中性为止.将离心得到的样品放在40℃的干燥箱中干燥后,放入马弗炉中600℃热处理1 h,或将洗涤至中性的沉淀直接冷冻干燥,得到棒状或针状的纳米颗粒.

为得到高比表面积的纳米颗粒,日本宫崎大学 Kijima[5]研究组将Ca(NO3)2,KH2PO4,C12(EO)9,Tween 60,HNO3和 H2O按1.67∶1∶1∶1∶8∶60的摩尔比配制成均相混合物,然后加入适量的氨水,混合均匀,静置48 h后得到条状的nHA,在此过程中,Tween 60发生水解,产生硬脂酸根与纳米颗粒表面上的Ca2+作用产生的硬脂酸钙阻止了颗粒团聚,并且C12(EO)9进一步地夹在硬脂酸钙和nHA之间,阻止颗粒团聚长大.产生颗粒在500℃烧结5 h,得到颗粒直径为4～20 nm,比表面积高达364 m2·g-1的纳米材料.Kim等[6]将500 mL 1.0 mol/L Ca(OH)2悬浮液和500 mL 0.6 mol/L H3PO4溶液,在25℃时直接混合反应得到nHA颗粒,在此过程中首先生成中间体CaHPO4·2H2O,之后中间体再慢慢转换为nHA,完全转换需要5 d.本方法的优点是不会在体系中引入其他离子.

1.3 水热法

水热法是在特制的密闭反应容器里,采用水溶液作为反应介质,在高温高压环境中,使得通常难溶或不溶的物质溶解后再重结晶的一种方法.它可直接得到结晶良好的粉体,无需做高温灼烧处理,避免了粉体的硬团聚和结构缺陷.

Wang等[7]将0.024 mol的 K2HPO4·3H2O和 0.024 mol的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入到100 mL去离子水中,加热到50℃溶解,加入1 mol/L的 KOH来调整体系p H值为12,搅拌2 h,同时,把60 mL 0.04 mol CaCl2的溶液慢慢加入到上述体系,搅拌后将悬浮液加到高压反应釜中分别在120℃和150℃温度下反应12～24 h,得到长径比不同的纳米棒.Zhang等[8]将2 mmol Ca(NO3)2·4H2O,0.2 g CTAB,用适量去离子水溶解,并用一定量的 HNO3(或氨水)调整体系p H值为4.0～9.0得到20 mL溶液1,另外又在15 mL去离子水中加入2 mmol柠檬酸钠和1.2 mmol(NH4)2HPO4得到溶液2,剧烈搅拌30 min溶液1后,将溶液2加入进一步搅拌20 min,将得到的混合溶液转移到不锈钢高压釜中在180℃温度下反应24 h.结果显示在不同p H值条件下可以得到不同长径比的纳米棒或由纳米棒自组装成的微米颗粒.梁琼[9]将0.281 0 g Ca(NO3)2和0.092 4 g(NH4)2HPO4混合于70 mL p H值为7.5(用氨水调节)的去离子水中;同时将等量的Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4混合于70 mL p H值为10.5的去离子水中,分别搅拌10 min后离心分离.将p H值为7.5条件下所得沉淀物分散于p H值为10.5的水溶液中,再将重新混合后的悬浮液倒入100 mL高压反应釜中,于180℃条件下水热处理10 h.冷却至室温,离心分离,用去离子水将沉淀洗涤3次后于80℃条件下干燥10 h,制得的 HA纳米棒的平均长径比最长(约为28).

1.4 前驱体水解法

前驱体水解法首先通过制备固体前驱体,然后控制不同的水解条件制备纳米颗粒,由于通过固相表面溶解的离子发生水解反应,反应条件可控性能好,所以日本人 Ito[10]将50 L 1.1 mol/L NH4H2PO4溶液与同样体积的2.7 mol/L Ca(NO3)2溶液混合后剧烈搅拌30 min得到白色的CaHPO4·H2O沉淀,过滤,在60℃和250℃烘干24 h得到 CaHPO4.在70℃时将0.4 g CaHPO4加入到40 L水中,用NH3·H2O或NaOH调整p H值在9.0～13.0,并调节水解体系的离子强度可以得到纳米针、纳米纤维、纳米片,实现了不同形貌的羟基磷灰石选择性制备.

1.5 模板法

模板法是指在模板所限的微小空间内进行材料制备,如以反相微乳液胶束内的“水池”为微反应器以及通过表面活性剂的相关基团对纳米晶不同晶面的吸附作用而制备各种纳米微粒材料.因反应物质能够以需要的适当浓度均匀分散于乳液液滴内并得到相应的离子基团保护,所以可以避免溶液中因局部浓度过高而引起的团聚问题,从而使反应均匀进行并可制备单分散性很好的微粒材料.

美国华盛顿大学Bose研究组[11]将一定量的Ca(NO3)2和H3PO4溶解到水中制成的水溶液作为水相,将壬基酚聚氧乙烯5醚和10醚为表面活性剂,加入到环己烷中溶解作为油相,按照一定的体积比把水相加入到油相中搅拌制成反相透明微胶束,用氨水来调节体系p H值为7,在室温下反应12 h,在不同温度下老化不同时间,得到前驱体干燥后在不同的温度下灼烧得到纳米颗粒,通过一系列的实验发现微乳液组成,p H值,老化时间、温度,以及金属离子的浓度都对纳米颗粒的表面积和形貌有着很大的影响.

Wei等[12]分别将Ca(NO3)2·4H2O(1.67 mol)和 (NH4)2HPO4(1 mol)加入到十二胺(0.2 mol),乙醇(10 mol),庚烷 (2 mol)和水 (600 mol)的混合溶液中搅拌.两种乳液在室温20℃时迅速混合反应,将得到沉淀过滤,洗涤数次,在反应体系p H=9时,得到纳米带宽度为1.37 nm,在p H=7时,纳米球直径为55～60 nm.周琰春等[13]将60 mL 3 mmol·L-1的Na2HPO4和3 mL 0.09 mol·L-1的CTAB 溶于200 mL三次蒸馏水中,用1 mol·L-1NH3·H2O调节溶液p H值为9～10,在20℃下磁力搅拌30 min,然后滴加5 mmol·L-1的CaCl2溶液60 mL,得到乳白色溶胶,反应过程中随时用N H3·H2O调节溶液维持p H值在9～10之间,反应继续陈化24 h,此过程一直伴随搅拌.反应完成后,用0.22μm的微孔滤膜过滤,将过滤得到的沉淀用去离子水和无水乙醇反复冲洗至其中无CTAB为止.将清洗干净的沉淀放置在45℃的真空烘箱中烘干,得到nHA是形貌均匀、成分单一、直径约20 nm的球形颗粒.

1.6 超声波法

传统的湿法制备超细粉末普遍存在的问题是易形成团聚结构,从而破坏了粉体的超细均匀特性.超声的空化和微射流产生的瞬时高温,高压和极快的传质速率不仅促进晶核的形成,同时起到控制晶核同步生长的作用,为制备超细、均一纳米粉末提供了良好的条件.斯洛文尼亚科研人员[14]用超声波产生的瞬间空化作用,使一定量的Ca(NO3)2,NH4H2PO4和尿素在水中发生均匀沉淀反应,用尿素分解调整体系p H值,制备了晶化的片状nHA.

1.7 机械化学法

机械化学法靠压碎、击碎等机械作用,将反应物充分地混合并使之进一步地发生化学反应,工艺简单,成本低廉.Yeong等[15]使用CaHPO4和CaO物质的量比为3∶2,在传统的球磨机上以乙醇为介质,氧化锆球为球磨珠充分混合物料,然后再放到一定尺寸的氧化铝容器中用不锈钢球为球磨珠进一步研磨,研磨20 h以上得到高度结晶的类球状羟基磷灰石纳米晶,尺寸为25 nm,比表面积为76.06 m2/g.

2 nHA在生物医学领域上的应用

2.1 癌症治疗

nHA安全无毒,可降解吸收或全部随粪便排出,因此其本身就可以作为药物.研究发现由于nHA表面存在大量的悬空键,提供较多的Ca2+离子,可以通过细胞膜使癌细胞过度摄入,产生细胞毒性,抑制癌细胞生长;另外,nHA可导致DNA损伤,形成DNA链缺口,影响遗传物质DNA的合成;诱导细胞周期阻滞和凋亡;抑制肿瘤细胞的端粒酶基因的表达,下调端粒酶活性的作用,从而限制许多恶性肿瘤的无限制生长,所以nHA目前已应用于抗肿瘤药物研究.Li等人[16]用荧光免疫检验法和MTT法研究发现:棒状和椭球状nHA纳米颗粒会使黑色素肿瘤细胞的细胞核收缩,破裂,细胞增殖受到抑制.

Liu等人[17]把人肝癌BEL-7402细胞与不同浓度的nHA放在一起培养,通过MTT法、荧光显微镜、流式细胞仪表征研究,发现nHA可以阻止肝癌细胞的增殖,引起癌细胞的凋亡,并且nHA的浓度和凋亡率呈现明显的正比关系.Cheng等人[18]从分子机制角度研究发现,nHA可以通过线粒体依赖和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶依赖途径诱导人体胃癌SGC-79 01细胞的凋亡来阻止细胞增殖.

Bauer[19]等发现肝癌细胞对nHA的吸收是通过网格蛋白介导的内吞作用完成,nHA对肝癌细胞作用是由于nHA团聚体阻塞了细胞内涵体或在nHA作用下溶菌酶发生降解产生毒性作用.付莉等人[20]研究发现长度约为60～80 nm、直径约为10～20 nm的nHA粒子,可以明显地抑制卵巢癌细胞株SKOV3的生长,其作用机制可能是在细胞周期的S期诱导肿瘤细胞凋亡.

2.2 药物载体

nHA对一些物质具有很强的吸附和承载能力.作为载体可以与蛋白质药物、核酸以及化疗药物结合进行靶向治疗,将大大增加局部药物浓度及作用时间,化疗药还可减少对全身器官的损害.

Tomoda等[21]研究发现,nHA晶体中a晶面越大,则表面上游离的Ca2+就越多,从而吸附较多的带有负电荷的蛋白如牛血清白蛋白,而带有正电荷的盐酸溶菌酶在nHA颗粒表面也有一定的吸附.Kandori等人[22]认为表面电荷近中性的肌血球素 (MGB)与纳米羟基磷灰石则通过分子间的范德华力结合.Ijntema K等[23]采用共沉淀法将蛋白类药物牛血清白蛋白(BSA)包裹于nHA晶粒中获得了具有缓释功能的药物释放体系,药物的释放速率由 HA的溶解过程控制.Sokolova等[24]研究发现,由于DNA中的磷酸根可以和钙离子产生较好的作用力,可以作为第二代基因载体,用于基因治疗,克服了病毒载体的不稳定性,细胞毒性以及较低的转染效率.Itokazu[25]报道ADM-HA作用骨肉瘤细胞效果较好,且 HA具有缓释作用,可以持续作用肿瘤细胞.刘静霆等[26]研究发现nHA负载阿霉素后,可明显促进肿瘤细胞的凋亡,降低阿霉素的骨髓抑制及心肌毒副作用.Ferraz[27]等用海藻酸钠/nHA复合微球可以担载青霉素、青霉素-克拉维酸、红霉素等不同类型的抗生素,它们不但具有抑菌性,而且还具有很好的缓释效果以及表现出好的造骨细胞增殖效果,可以作为新一代的注射骨材料和药物载体.

Zhang等人[28]进一步对海藻酸钠/nHA复合微球担载药物双氯芬酸和缓释效果进行研究,发现nHA是微球内部结构的交联剂,可以限制海藻酸钠聚合物链的移动,并且它还改变了海藻酸钠微球表面结构,限制了球体的收缩率,增加了担载药物量,增加了释放时间,与海藻酸钠微球缓释时间相比增加了8 h.Talal等[29]研究发现 HA-聚乳酸-聚乳酸纤维与聚乳酸-聚乳酸纤维相比表现出较好的蛋白吸附行为,吸附到的蛋白可持续释放96 h,因此可以应用于生物蛋白药物的输运系统.Yang等[30]将布洛芬药物担载在含荧光物质铕离子的nHA上面,可以通过荧光性能的改变来判断药物释放的情况,因此是一种理想的药物载体材料.

2.3 齿科材料

由于人工合成的nHA抗菌性能较差,而结晶性和结构稳定性较高,从而不易生物降解,不利于骨缺损部位的骨生长.并且nHA的物理、化学及生物性能取决于其晶型结构和组成,所以在nHA中掺入一些金属元素是提高其性能的有效方法.

林英光等人[31]将锌掺入nHA中可形成置换式固溶体,nHA原有晶格发生畸变,材料的结晶性、溶解性及生物降解性等性能发生改善,从而具有更好的生物学性能、骨缺损修复能力和抗菌性能.纳米ZnHA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌的抑菌率均高于nHA的抑菌率,且抑菌率随 r值的增加而增大.

程江等人[32]在传统沉淀法制备nHA工艺中掺入锶盐,制得掺锶nHA,其抗致龋菌性能得到提高,推测其抗菌机理为:掺锶后溶解性能提高,在一定的时间内解离出更多的带正电荷的Sr2+能吸附细胞膜带负电的细菌,并可能与细胞膜中的蛋白质结合破坏微生物细胞的能量代谢系统,使细菌生长受阻或死亡.Kim等人[33]研究发现,在 HA中掺入银离子,可以通过延缓细菌的新陈代谢来抑制细菌生长.Ahn等[34]为提高nHA生物陶瓷材料的韧度,在制备纳米结构的羟基磷灰石生物陶瓷过程中,引入3%(质量百分比)的氧化钇和氧化锆复合纳米颗粒,与传统的羟基磷灰石材料相比,显示出优异的化学和机械性能,断裂韧性接近骨密质.Li等人[35]发现粒径大小约为20 nm的掺杂铽的nHA毒性小,且荧光周期长,在医学诊断上有着很好的应用前景.

2.4 人工骨材料

人工合成的nHA一方面具有良好的生物相容性、生物可降解性、骨传导性,另一方面其脆性和较低的机械强度又限制了其临床应用.人体骨可近似看作以骨胶原为基体材料,以羟基磷灰石为增强材料而构成的复合材料,因此以羟基磷灰石为增强材料,以聚合物特别是生物可降解聚合物为基体的复合材料与体骨的成分和结构相似,可以弥补金属和陶瓷材料的不足,有望成为理想的人工骨替代材料.

邓霞等[36]用水热合成的nHA作为无机相与新型的可降解的脂肪族聚酯酰胺(PEA)按不同比例复合,nHA与PEA之间既有化学键合又有分子间的相互作用,可在二者之间形成良好的化学界面,使复合材料能更好地传递外应力,达到既增强又增韧的目的,使材料性能得以改善.其拉伸模量从188 MPa增至323 MPa,同时nHA复合材料又赋予材料以较高的生物活性,体外将成骨细胞和材料联合培养,细胞显示出良好的生长增殖活性.复旦大学邵正中等人[37]将nHA悬浊液与丝素蛋白(SF)溶液采用同轴共纺法制备nHA(芯部)/SF(皮层)双组分电纺纤维,并分别以SF电纺纤维、SF/HA复合纤维和SF/HA“皮-芯”纤维为有机基质,在特定的条件下显现出很好的诱导羟基磷灰石等无机物在其表面沉积矿化的能力,有可能用以模拟动物骨骼这类无机/有机纳米复合材料,为进一步的实行骨修复的动物或临床实验等提供基础.

Chen等[38]采用把NH4H2PO4加入到Ca(NO3)2与壳聚糖(CS)混合溶液中,用氨水调节p H为10制备出 HA/CS纳米复合材料,羟基磷灰石颗粒直径约为20～30 nm,长约100 nm.Li等[39]采用原位沉析法制备的羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的弯曲强度为67.8 MPa,压缩强度为47.8 MPa,比骨松质高2～3倍,基本上满足了骨替代材料对力学性能的要求.Nukavarapu[40]把可生物降解的聚二苯丙氨酸乙酯膦腈与粒径为100 nm的nHA混合制备成的微球孔径为86～145μm,压缩模量达到46～81 MPa,与自然骨相近,并且表现出很好的成骨细胞吸附性,细胞增殖和碱性磷酸酶表达,在骨组织应用方面有很好的潜力.Sundaram[41]等制备了nHA和壳聚糖复合颗粒,可以通过物理、化学、生物吸附作用吸附水中的F-,是一种高效、成本低、生物相容性的去氟剂.Reverchon[42]等用超临界CO2法制备了nHA/聚乳酸复合材料,孔隙率超过90%,最大的压缩模量达到123 kPa,溶剂残留率低于百分之五,可作为理想的人工骨材料.尽管硅橡胶具有生物相容性在骨科材料中有一些应用,但是其生物惰性和柔性影响了其进一步应用,Wen[43]等人在硅橡胶材料中引入nHA,很好地克服了上述问题,当nHA含量在50%时能达到最好的机械性能,改善了其使用效果.

3 结论

综上所述,随着纳米材料在医学领域中的应用日益广泛,nHA以其安全无毒、生物相容性、可生物降解等优点成为科研人员热点关注的纳米材料.至今为止,它的新制备方法还在不断涌现,其在生物医学领域中的应用也在不断推进,但其目前还更多地用于生物医学体外实验等基础性研究中.相信随着科学家的继续努力,nHA会越来越多地应用于生物医学领域.

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Research Progress in Preparation of Nanoscale Hydroxyapatite and Its Application in Biomedicine Field

LI Bin-jie,YAO Su-mei,LI Shu-lian,MA Yuan-fang
(1.Institue of Immunology,Medical School ofHenan University; 2.Institute of Molecular Medicine,Medical School of Henan University; 3.Key L aboratory f or S pecial Functional Materials of Ministry of Education,Henan University,Kaif eng475004,Henan,China)

A review is given about research progress of preparation and application of nanoscale hydroxyapatite in biomedicalscience.Commonly used methods for preparing nanoscale hydroxyapatite,including sol gel method,chemical precipitation method,hydrothermal method,precursor-hydrolysis method,template method,ultrasonic method,and mechno-chemical method are highlighted.Besides,the application and development of nanoscale hydroxyapatite in the field of biomedicine,including cancer therapy,drug carrier,dential materials and synthetic bone are briefed.

nanoscale hydroxyapatite;preparation;application;research progress

TQ 246.3

A

1008-1011(2010)05-0090-07

2010-04-29.

河南省杰出人才创新基金项目(074200510014),2008年度河南大学校内科学研究基金项目(2008YBGG003).

李宾杰(1971-),男,副教授,博士,主要从事纳米医用材料研究.E-mail:lbj821@yahoo.com.cn.＊

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