大鼠动脉内局部低温脑梗死模型的建立和特点*

赵沃华 吉训明 凌 锋 吴 浩 赵洪洋 朱贤立

1华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科,武汉 430022

2首都医科大学北京宣武医院神经外科,北京 100085

为模拟临床上动脉内溶栓和药物灌洗治疗,我们根据经典实心线栓大脑中动脉(middle cerebral atery,MCA)缺血模型的制作方法[1],利用特制的带导丝的中空管,制作了中空管线栓MCA缺血模型,并观察了经中空管灌洗冷生理盐水达到脑局部低温的效果。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

30只成年雄性SD大鼠,体重260～300 g,分为经典线栓组、中空管线栓组和低温盐水灌洗组。实验前1 d晚上开始禁食不禁水。大鼠经口气管插管接小动物呼吸机(Model 683,Harvard仪器公司,美国)和麻醉机(Model 61010,A.M Bickford公司,美国)。麻醉剂选用3.5%恩氟烷,混合于70%一氧化氮和30%氧气的混合气体中。肌肉注射维库溴铵(Norcuron,万可松,0.6 mg/kg)维持麻醉状态。右侧股动脉置PE-50管,与压力感受器连接,持续记录平均动脉压。定期监测大鼠血气(248 pH血气分析仪,Chiron Diagnostics Limited,英国)和血糖(ACCU-CHEK Active GN 03173351,罗氏公司,德国)。大鼠置于小动物控温毯(TCAT-2AC,Harvard仪器公司,英国)及特制颞肌温度反馈加热头灯下。在整个手术操作过程中维持直肠温度在37.5℃,右侧颞肌温度维持在37℃。

1.2 经典线栓MCA缺血模型制作

根据Longa等[1]的方法,略作改动。显露和游离右侧颈总动脉主干及颈内动脉和颈外动脉近端。电凝后切断右侧颈外动脉近分叉处分支,3-0丝线于颈外动脉分叉处15～20 mm结扎并切断颈外动脉。微型动脉夹临时阻断右侧颈总动脉血流。选取外径0.24 mm的prolene线段,经颈外动脉残端插入。插入深度约为18～21 mm,根据脑血流量监测结果监测线栓是否到位。线栓到位后,在颈外动脉残端处结扎固定线栓。松开颈总动脉微型动脉夹。要求颈总动脉血流临时阻断时间＜5 min。缝合皮肤。缺血2 h后,大鼠再次麻醉,拔除线栓,使血液再灌注,颈外动脉残端结扎,皮肤缝合。

1.3 中空管线栓MCA缺血模型制作

用特制的中空管线栓替代传统实心线栓制作MCA缺血模型。30 mm长的PE50管,一端在酒精灯下烤热并拉伸,用螺旋测微器测量头端直径,选取头端直径为0.24 mm的栓子,内腔以恰好通过直径0.11 mm的尼龙线为宜。头端修剪为长25 mm,尾端为正常PE50管,长度为5 mm;内腔注入肝素化生理盐水,再插入长35 mm,直径为0.11 mm尼龙线,浸泡在肝素化盐水中,作为中空管线栓。模型制作方法同经典线栓组。

1.4 局部生理盐水灌洗模型制作

如上法制作中空管线栓MCA缺血模型,在血液再灌注之前10 min,将中空管线栓向后拔出约2～3 mm,拔出中空管内的尼龙线,以微量泵向中空管内注入20℃生理盐水约6 mL(泵入速度为0.6 mL/min,持续约10 min)。在向动脉内灌洗生理盐水时,颈总动脉血流以微型动脉夹临时阻断。灌洗结束后,撤除右侧颈总动脉临时阻断夹,拔除中空管线栓,使血液再通。颈外动脉残端结扎。

1.5 局部脑血流量的测定

应用激光血流测定仪(PeriFlux System 5000,Perimed AB公司,瑞典),对右侧MCA供血区皮质血流进行测定。大鼠麻醉后,在前囟后方3 mm,外侧3 mm以高速磨钻钻孔。将塑料测量电极固定器以EC耳脑胶牢固固定于大鼠颅骨上。在缺血开始前测定脑血流的基线值。当线栓到位时,脑血流测定值至少需降至基线值的25%以下。未达到上述标准的大鼠排除在实验组之外。

1.6 脑温监测

皮质测温点选取前囟外侧3 mm处,深度约3 mm;髓质测温点选取前囟后方3 mm,外侧5 mm,深度约5 mm。将针状测温电极插入,连接测温仪(Physitemp仪器公司,美国);在动脉内生理盐水灌洗前,灌洗过程中和灌洗后 60 min内,观察右侧MCA供血区脑组织温度。

1.7 神经功能评定

在大鼠缺血前、缺血中(缺血开始后1 h)、缺血后24和48 h分别对大鼠肢体运动功能进行评定。采用Belayev等[2]推荐的十二分法对大鼠运动功能进行评定。神经功能评分为0～12分,正常是0分,最高12分。

1.8 脑梗死体积的测定

脑缺血48 h后,大鼠以过量苯巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,4%多聚甲醛心脏灌注。大鼠脑组织置于特制大鼠脑冠状切片适配器上,从前到后(从额极至枕极)取冠状切片6片。脑组织置于温四氮唑红(tetrazolium chloride,TTC)溶液中染色15～30 min。数码相机照相,以图像分析软件Image Proplus 5.0测量脑梗死体积。为减少脑水肿造成的误差,采用Swanson等[3]推荐的间接法进行脑梗死体积的计算。

1.9 统计方法

2 结果

2.1 生理指标

平均动脉压、直肠温度、血糖水平和血气指标在整个实验过程中维持在基本正常水平。各实验组之间的结果差异无统计学意义(均P＞0.05)。在应用低温盐水灌洗时,颞肌温度和直肠温度略有下降,但也维持在36.5℃以上;停止低温盐水灌洗后,逐渐恢复至正常水平。

2.2 神经功能评分

中空管线栓缺血组大鼠在缺血后1、24和48 h的神经功能评分[分别为(10.10±0.82),(6.10±1.20)和(4.30±1.34)]同经典线栓缺血组各时间段神经功能评分[分别为(9.60±1.17),(6.10±1.20)和(4.90±1.45)]相比,差异均无统计学意义(P值分别为0.258,1.000,0.291);低温盐水灌洗组1 h时神经功能评分(10.00±0.82),与同时间段中空管线栓组相比差异无统计学意义(P=0.819),而24和48 h神经功能评分[分别为(2.30±1.16)和(1.90±0.88)]与同时间段中空管线栓组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.01)。

2.3 脑温监测

在低温盐水灌洗组中,在血液再灌注之前,经中空管注入20℃冷生理盐水,MCA供血区皮质温度从(37.0±0.1)℃降低至(32.8±0.2)℃,髓质温度从(37.5±0.1)℃降低至(33.2±0.3)℃。

2.4 脑梗死体积

经典线栓组和中空管线栓组的脑梗死范围类似,均位于同侧的颞顶部。中空管线栓组的脑梗死体积[(41.81±2.88)%]同经典线栓组[(41.92±2.17)%]相比,差异无统计学意义(P=0.922);而低温盐水灌洗组脑梗死体积[(22.37±1.86)%]同中空管线栓组相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

我们模拟临床上动脉内溶栓的方法,建立了大鼠中空管线栓MCA脑缺血模型。当线栓堵塞MCA开口处,可以造成MCA供血区缺血;拔除中空管线栓,可以使血液再灌注。当回拉线栓1～2 mm,抽出中空管内导丝,经中空管向MCA供血区注入冷生理盐水,可以达到缺血区脑局部低温。

目前应用最广泛的MCA缺血模型是Longa等[1]所改进的线栓MCA缺血模型,具有无需开颅、操作简单、梗死体积稳定、重复性好等特点。我们改良的模型,以中空管线栓,代替传统线栓,能更好地模拟临床上介入治疗急性脑缺血的过程。同传统线栓模型相比,中空管线栓模型能够产生类似的神经功能症状,脑梗死的范围和体积也基本相同。

急性MCA闭塞静脉内溶栓建议在症状开始3 h之内进行,动脉内溶栓建议在症状开始6 h之内进行;否则,过长的缺血时间可能加重脑水肿,并增加脑出血的风险[4]。动脉内溶栓治疗是将高浓度的溶栓药物直接应用于血栓处,较静脉内溶栓能够降低溶栓药物浓度,增加血管再通率,减少溶栓药物的副作用[4]。虽然动脉内溶栓治疗需要在发病后尽早进行,但很多患者到达医院时,已经超过了溶栓治疗的时间窗,失去了最佳的治疗时机[4-5]。因此,尽可能延长动脉内治疗的时间窗是缺血性脑血管病治疗的重要方面。

在对缺血性脑损害的研究中,低温治疗是目前唯一在实验研究和临床研究均证实对人有效的神经保护措施[6]。目前,诱导低温的方法主要包括身体表面应用冰毯,冷空气降温,乙醇皮肤擦浴,或者在头部、腹股沟、腋窝和颈部放置冰袋等。也有介绍应用静脉内热交换机应用于临床诱导全身低温的报道[7]。但是应用这些方法,为了诱导和维持靶点温度,需要耗费医务人员大量的精力,并可能引起严重并发症,如心律失常、寒颤、感染和凝血功能障碍等。

应用我们的方法,达到的动脉内局部低温具有以下特点:

①动脉内局部低温是仅对缺血局部脑区的低温。局部头部低温同全身低温相比,效果类似,但并发症更少。我们所用的局部动脉内低温的方法,是对局部缺血脑区的低温,对侧脑组织温度变化相对较小,对全身温度的影响就更小。

②20℃低温生理盐水局部动脉内灌洗可达到轻度低温。虽然中度低温和深低温具有明显的保护作用,但也有很多的副作用,如心律失常、寒颤、肺部感染等。轻度低温的治疗效果可能不如重度低温,但是并发症明显减少。在我们的实验中,应用20℃生理盐水灌洗达到的低温属于轻度低温的范围。Ding等[8]的实验中应用类似方法,缺血区皮质和髓质温度分别降低至33.4和33.9℃。

③动脉内局部低温开始于血液再灌注之前。目前现有的低温实施时机有缺血期低温、再灌注期低温和缺血期持续至再灌注期低温。缺血发生当时就实施低温在理论上和实验中是可行的,但在临床实际工作中往往是很难做到的。患者大都是在发病后就诊的,有一个就诊的过程,所以无法在缺血当时就实施低温。在实验研究中,开始应用低温治疗的时机不一。一般认为,低温应用得越晚,效果就可能越差。

④动脉内局部低温持续时间约1 h。在先前的研究中,低温的持续时间多在1～3 h之间。研究发现,较长时间的低温,能更明显减少脑梗死体积。我们所应用的局部动脉内低温,持续时间约1 h左右。

⑤局部盐水灌洗可能在预防缺血再灌注损伤方面也具有一定的作用。Ding等[9]发现应用37℃常温盐水动脉内灌洗,能够减少缺血脑组织细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的表达和减少白细胞向缺血区域的浸润。而ICAM-1是急性炎症反应的表达产物,能够诱导血液中的白细胞向缺血区浸润。本实验中大鼠脑梗死体积的减少和神经功能评分的好转,也有可能是局部盐水灌洗,减少了再灌注损伤引起的炎性反应。

临床上,借助导管可以到达急性梗塞的脑血管(最常见是MCA),进行机械溶栓或者抽吸血凝块。通过微导管也可以经动脉内给予溶栓药物。机械性溶栓,可以机械粉碎血凝块,同时结合药物溶栓的方法,也已经应用于临床。在血液再灌注之前,导管通过梗塞部位,到达梗塞血管的远端,先进行缺血局部盐水灌洗的方法是可行的。由于人的血管比大鼠的血管管径要粗得多,在临床上应用动脉内局部灌洗相对要容易很多。这种方法同样为低温治疗联合血管内药物治疗,提供了新的途径。

[1] Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversi-ble middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2] Belay ev L,Alonso O F,Busto R,et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture.Neurological and pathological evaluation of an improved model[J].Stroke,1996,27(9):1616-1622.

[3] Swanson R A,Morton M T,T sao-Wu G,et al.A semiautomated method for measuring brain infarct volume[J].J Cereb Blood Flow Metab,1990,10(2):290-293.

[4] Jahan R.Hyperacute therapy of acute ischemic stroke:intraarterialthrombolysis and mechanicalrevascularization strategies[J].Tech Vasc Interv Radiol,2005,8(2):87-91.

[5] Hacke W,Brott T,Caplan L,et al.Thrombolysis in acute ischemic stroke:controlled trials and clinical experience[J].Neurology,1999,53(7 Suppl 4):S3-S14.

[6] Bernard S A,G ray T W,Buist M D,et al.Treatment of comatose survivors of out-of-hospital cardiac arrest with induced hypothermia[J].N Engl J Med,2002,346(8):557-563.

[7] Krieger D W,De Georgia M A,Abou-Chebl A,et al.Cooling for acute ischemic brain damage(cool aid):an open pilot study of induced hy pothermia in acute ischemic stroke[J].Stroke,2001,32(8):1847-1854.

[8] Ding Y,Li J,Luan X,et al.Local saline infusion into ischemic territo ry induces regional brain cooling and neuroprotection in rats with transient middle cerebral artery occlusion[J].Neurosurgery,2004,54(4):956-964.

[9] Ding Y,Young C N,Li J,et al.Reduced inflammato ry mediator expression by pre-reperfusion infusion into ischemic territory in rats:a real-time polymerase chain reaction analysis[J].Neurosci Lett,2003,353(3):173-176.