宫颈癌组织中SOD2基因的表达及意义

张济敏,胡云霞,邹 芳,郭宝枝,郭华峰,苑中甫,王明臣

(1.郑州市妇幼保健院 妇科激光治疗室,河南 郑州 450053;2.郑州大学第一附属医院 妇产科,河南 郑州 450053;3.郑州大学医学院生化教研室,河南 郑州 450053)

宫颈癌组织中SOD2基因的表达及意义

张济敏1,胡云霞1,邹 芳1,郭宝枝1,郭华峰1,苑中甫2,王明臣3

(1.郑州市妇幼保健院 妇科激光治疗室,河南 郑州 450053;2.郑州大学第一附属医院 妇产科,河南 郑州 450053;3.郑州大学医学院生化教研室,河南 郑州 450053)

目的:分析SOD2基因在宫颈浸润癌(ICC)、宫颈上皮内瘤变(CIN)及正常宫颈上皮(NCE)组织中的mRNA表达情况,揭示氧化应激在宫颈癌发生中的可能作用。方法:应用RT-PCR分别扩增18例宫颈癌组织、20例宫颈上皮内瘤变及20例正常宫颈组织中SOD2基因片段,半定量分析其表达情况。结果:与宫颈上皮内瘤变及正常宫颈上皮相比,宫颈癌组织中SOD2基因的mRNA表达显著下降(P＜0.05)。结论:SOD2基因表达低下导致氧化应激加剧,在宫颈癌的发生中可能起重要作用。

锰超氧化物歧化酶;宫颈癌;基因表达

宫颈癌是威胁女性生命的第二大恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌。宫颈癌发生的确切分子机制尚未充分阐明[1]。近年研究[2]表明,活性氧(ROS)参与肿瘤的启动和促进过程。SOD2基因编码锰超氧化物歧化酶(MnSOD),是体内主要的超氧自由基清除剂,保护细胞免受ROS的损伤。研究[3]显示,SOD2的基因表达量伴随细胞的癌变过程呈正相关下降,提示SOD2基因系潜在的新型肿瘤抑制基因,本研究旨在揭示SOD2基因在宫颈浸润癌(ICC)、宫颈上皮内瘤样变(CIN)及正常宫颈上皮(NCE)中的mRNA表达状态,以期为寻求宫颈癌基因诊断和治疗的靶向基因提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 标本的收集与处理

标本取自郑州市妇幼保健院、郑州大学第一附属医院妇产科宫颈活检及手术切除的病理标本38例。受检患者中宫颈上皮内瘤变患者(CIN)20例,其中Ⅰ级6例、Ⅱ级8例、Ⅲ级6例。宫颈浸润癌(ICC)患者18例,全部经术后病理检查确诊,病理分级G1～G2级12例、G3级6例;FIGO 分期Ⅰa～Ⅰb 6例、Ⅱa 6例、Ⅱb及以上6例。另取20例正常宫颈上皮(NCE)作为对照,为子宫肌瘤患者手术中切除的正常宫颈组织。所有标本取出后立即放入无RNase的EP管中并放入液氮中保存待测。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA的提取 从液氮中取出标本组织,加液氮在研钵中研碎,用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取总RNA。

1.2.2 cDNA的合成 所采用的逆转录反应体系:RT-Mix 9 μ L(5×RT 缓冲液含 50 mmol/LMgCl26 μ L,10 mmol/L 4 ×dNTP 2 μ L,RNasin 40U,AMV 2U,通用 引物 1 μ L),提 取 总 RNA 5 μ L,DEPC水补足30 μ L,42℃水浴逆转录1 h。

1.2.3 PCR扩增 SOD2和β-actin扩增引物由上海生工生物公司合成。SOD2引物(上游):5′GTGGTGGTCATATCAATCAT3′,SOD2 引物(下游):5′GGCCTGT TGT TCCTTGCAGT3′,扩增产物长度252bp;内参照 β-actin(上游):5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG 3′,β-actin(下游):5′CT T TGCGGATGTCCACGTC 3′,扩增产物长度 393bp。扩增反应体积为 30 μ L:逆转录所得 cDNA 5 μ L,Mix(含有SOD2引物及 β-actin内参照引物)6 μ L,T aq 酶 0.5 μ L,去离子水 18.5 μ L,94 ℃预变性5min,94℃变性50 s,55℃复性50 s,72℃延伸60 s,三温循环35次,72℃末端延伸5min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 配制质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳(含 EB 0.5 μ g/mL),取 PCR扩增产物9 μ L点样电泳,以 3V/cm 电泳 40min。使用英国SYNGENE凝胶成像分析系统,对扩增产物的电泳条带进行灰度扫描,分析测定积分吸光度值(IA)。每例标本SOD2基因mRNA的相对表达量以SOD2片段的IA/β-actin的 IA的比值表示。采用 SPSS 10.0统计学软件对结果进行统计学处理。

2 结果

2.1 宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织中SOD2和β-actin基因 RT-PCR扩增结果(见图1)

图1 SOD2基因的mRNA表达

2.2 宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织中SOD2基因的mRNA表达量分析

宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织中SOD2基因的mRNA表达水平()分别为0.45±0.11、0.92±0.24、1.67±0.35。宫颈癌组织中SOD2基因的mRNA表达水平较宫颈上皮内瘤变及正常宫颈上皮组织中显著降低,统计学处理有显著性差异(P＜0.05)。

3 讨论

由活性氧自由基引发的氧化应激损伤在包括肿瘤在内的诸多疾病中发挥重要作用。活性氧包括超氧阴离子自由基(O˚2)、羟自由基(OH˚)等。SOD是体内以O˚2为唯一底物的天然酶类自由基清除剂,在保护细胞免受ROS的氧毒性损伤中发挥最重要作用。真核生物中有CuZnSOD和MnSOD 2种同工酶。SOD2基因编码MnSOD存在于线粒体基质中。线粒体呼吸链电子传递是体内活性氧产生的最主要途径,MnSOD可及时清除自由基以防止自由基的累积,因此SOD2基因的表达和调控对维系机体自由基代谢平衡至关重要。ROS还作为机体重要的信号分子,参与调控细胞的分化、增殖、凋亡等,与肿瘤的发生密切相关。研究[3]认为,MnSOD是一种新的肿瘤抑制因子,MnSOD的基因表达与肿瘤的分化程度和恶性表型相关。本研究显示,宫颈癌中MnSOD基因的mRNA表达水平较宫颈上皮内瘤变及正常宫颈上皮组织中显著低下,提示MnSOD的下调表达导致氧化应激加剧在宫颈癌的发生中亦起重要作用。但关于MnSOD参与肿瘤发生的机制,Huang等[4]认为肿瘤细胞MnSOD表达下降,导致细胞内ROS增加,高浓度的ROS可导致DNA氧化损伤,关联细胞增殖转化和肿瘤的发生。此外,MnSOD表达异常可改变细胞内包括O˚2在内的ROS的净水平,后者作为细胞内重要的信号分子[5],调节某些转录因子活性,从而使细胞增殖相关的信号转导通路发生改变,可能是MnSOD介导肿瘤发生的另一分子机制,有待深入研究。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global caneer statisties[J].Caneer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Sun Y.Free radicals,antioxidant enzymes and carcinogenesis[J].Free Radical Biol&Med,1990,8(6):583-599.

[3]Bravard A,Sabatier L,Hoffschir F,et al.SOD2:a new type of tumor-suppressor gene?[J].Int J Cancer,1992,51(3):476-480.

[4]Huang Y,Peng J,Oberley LW,et al.Transcriptional inhibition of manganese superoxide dismutase(SOD2)gene expression by DNA methylation of the 5′-CPG island[J].Free Redical Biol Med,1997,23(2):314-320.

[5]Zhao Y,Xue Y,Oberley TD,et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase suppresses tumor formation by modulation of activator protein-1 signaling in a multistage skin carcinogenesis mode[J].Cancer Res,2001,61(16):6082-6088.

[责任编辑 时 红]

Gene expression and significance of manganese superoxide dismutase in cervical cancer tissue

ZHANG Ji-min1,H U Yun-xia1,ZOU Fang1,GUO Bao-zhi1,Guo Hua-feng1,YUAN Zhongfu2,WANGming-chen3(1.Zhengzhou Maternity and Child Health Care Hospital,Zhengzhou,Henan 450053,China;2.Department of Gynecology,the First A f filiated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450053,China;3.Department of Biochemistry,Medical College of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective:To investigate the mRNA expression level of manganese-containing superoxide dismutase(SOD2)gene in human cervical cancer tissues,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and normal cervical epitherical(NCE)tissues and to unravel the effect of oxidative stress in the pathogenesis of cervical cancer.Methods:The level of mRNA expression of SOD2gene in 18 cases of cervical cancer tissues and 20 specimens of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and 20 normal cervical tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:The expression level of SOD2in cervical cancer tissues significantly decreased compared with those of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and normal cervical tissues.Conclusion:The down regulation expression of SOD2gene,resulting in the enhancing of oxidative stress,may play an important role in the pathogenesis of cervical cancer.

manganese-containing superoxide dismutase;Cervical cancer;Gene expression

R737.33

A

1672-7606(2010)03-0188-03

2010-05-10

张济敏(1965-),女,河南 开封 人,主管护师,从事妇科疾病物理治疗工作。