短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法的建立及其应用

谭愈昱，林健，晋溶辰，唐炜立，黄干，彭健，周智广

·论著·

短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法的建立及其应用

谭愈昱，林健，晋溶辰，唐炜立，黄干，彭健，周智广

目的建立短片段扩增杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因的序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）分型法。

受体，KIR； 聚合酶链反应； 基因

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(3):165-170

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobin-like receptor，KIR）基因编码一族激活性和抑制性 KIR 受体，表达在 NK 细胞和部分 T 细胞表面，通过特异性识别靶细胞表面的MHC-I 类分子，转导激活或抑制信号，从而调节NK 细胞和 T 细胞的活性[1]，在抗感染、肿瘤监测、移植免疫和自身免疫性疾病等方面发挥重要作用。KIR 基因具有高度多态性，目前已明确的有 16 个KIR 基因，其检测方法主要为序列特异性引物聚合酶链反应（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）。但同一 KIR 基因及其等位基因的检出率因所采用的特异性引物以及相应的扩增产物长度的不同而不同。扩增产物为长片段（0.5 ～ 2 kb）者，对样本基因组 DNA 的要求高，增加 KIR 基因的漏检率。同时，随着 KIR 新等位基因和新座位的发现，既往的 PCR-SSP 分型方法存在漏检和误检的可能。因此，本研究在 Vilches等[2]工作基础上建立短片段扩增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法，将其与长片段扩增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法进行比较，并检测湖南汉族人群KIR基因的分布频率，初步评价其应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 通过流行病学调查、健康体检等方式，在排查自身免疫性疾病、糖尿病、肿瘤等疾病史及家族史后，随机选取 330 例湖南汉族健康志愿者，签署知情同意书后，抽取 4 ml EDTA 抗凝全血，备用于基因组 DNA 的提取。

1.1.2 试剂与仪器 Taq DNA 聚合酶和 dNTP购自加拿大 Formentas 公司；DNA Marker 购自天根生化科技（北京）有限公司；用于提取 DNA 的饱和酚、酚-氯仿、异戊醇均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；蛋白酶 K 购自美国 Amresco公司；5 例已知基因型的标本（标本 1：KIR2DL1、KIR2DL3 和 KIR3DL1 阳性；标本 2：KIR2DL2、KIR2DS2 和 KIR3DL1 阳性；标本 3：KIR2DS4、KIR3DS1 和 KIR2DS5 阳性；标本 4：KIR2DL5阳性；标本 5：KIR2DS1 阳性）由瑞典 Karolinska学院的 Carani 教授馈赠；GelDoc2000 凝胶成像系统为美国 Bio-Rad 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 基因组 DNA 抽提 采用苯酚-氯仿法。

1.2.2 引物合成 参照文献[2]方法合成短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法引物（表 1），反应 1 ～ 15 的内对照引物为 PIC-F1（5’ GAGGTA ACTGTGCTCACGAACAGC 3’）和 PIC-R1（5’ GG TCCATACCCCAGTGCTTGAGAAG 3’），扩增产物长度 283 bp；反应 16 的内对照引物为 PIC-F1 和PIC-R2（5’ CACGTTCTCTGTAGTCTCTGGG 3’），扩增产物长度 608 bp。长片段扩增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法的引物参照文献[3]。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并经过 Blast 验证。

1.2.3 KIR 基因 PCR-SSP 分型 各 KIR 基因均采用 2 ～ 3 条 KIR 基因上下游引物加一对内对照引物体系。

⑴短片段扩增 KIR 基因：PCR-SSP 反应总体系 10 μl，含 10 × PCR 缓冲液 1 μl、dNTP 终浓度0.2 mmol/L、MgCl21.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶0.5 U、各 KIR 引物终浓度 0.5 ～ 2.5 μmol/L、内对照引物终浓度 0.1 μmol/L、模板 DNA 终浓度为10 ng/μl。PCR 循环条件：95 ℃ 预变性 2 min；94 ℃ 变性 10 s，65 ℃ 退火 40 s，共 10 个循环；94 ℃ 变性 20 s，61 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 20 个循环。

⑵长片段扩增 KIR 基因：PCR-SSP 反应体系及循环条件参照文献[3]方法进行。

1.2.4 KIR 基因型的判定 所有 PCR 扩增产物均行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳后于 GelDoc2000 凝胶成像系统上分析结果。内对照条带及目的基因条带均出现者，相应的 KIR 基因为阳性；仅出现内对照条带者相应的 KIR 基因为阴性；内对照条带未出现者无论目的基因条带出现与否都需重新扩增。

1.2.5 质量控制 采用 5 例已知基因型的标本作为阳性质控，且同时设立阴性对照和空白对照。所有结果为阴性的标本或长片段与短片段扩增KIR 基因结果不一致的标本均重新扩增 1 ～ 2 次，判读结果。

1.3 统计学处理

KIR 基因出现频率（f），即 KIR 基因的阳性率通过直接计数法计算，计算公式为：f = 基因阳性例数/检测总例数；KIR 基因频率（gene frequency，GF）的计算公式为：GF = 1 –（1 – f）1/2。2 种分型方法对 KIR基因检测阳性率的比较采用 SPSS 13.0 统计软件四格表 χ2检验公式计算，当 1 ≤理论频数 ＜ 5 时，使用连续性校正，以 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

表 1 短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法引物Table 1 Primers used for KIR genotyping by PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments

2 结果

2.1 短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的建立

本实验所建立的 PCR-SSP 分型法，在湖南汉族人群中可检测出目前已知的 16 个 KIR 基因，其中 KIR2DS4 基因检测可区分至 KIR2DS4*001（133 bp）、KIR2DS4*003/004/006/007（111 bp）及KIR2DS4 杂合子，所有 KIR 基因扩增产物电泳后条带清晰（图 1），与已知基因型的阳性质控标本结果判断一致。

2.2 短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的应用

应用短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法检测 330 例湖南汉族健康志愿者的 DNA 标本，其中 KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因的阳性率均为 100%；KIR2DL1、KIR2DL3、 KIR3DL1、KIR2DS4、KIR2DP1 基因的阳性率较高，分别为 96.4%、96.1%、94.2%、94.2%、99.7%；其次 KIR2DL2、KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1 基因的阳性率均 ＜40%（表 2）。另外，KIR2DS4*001、KIR2DS4*003/ 004/006/007 及 KIR2DS4 杂合子的阳性率分别为46.1%（152/330）、19.4%（64/330）、28.8%（95/330）。

2.3 长、短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的比较

从 330 例湖南汉族健康志愿者的 DNA 标本中随机选取 100 例用于长、短片段扩增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法的比较。长、短片段扩增 KIR基因的 PCR-SSP 分型法（长、短片段方法）均可检测出目前已知的 16 个 KIR 基因，但对同一基因的检测阳性率存在差异，将 2 种分型方法检测结果不一致的标本经重复扩增验证后结果如表 3、表 4。2 种分型方法检测 KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1 基因的阳性率一致，但长片段方法检测其余 KIR 基因的阳性率均低于短片段方法，即存在一定的漏检，其中长、短片段方法检测 KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1 基因的阳性率差异具有统计学意义（P ＜0.05），并以 KIR2DS4 基因差异最为显著（62% vs.94%，P ＜ 0.001）。同时，长片段方法对 KIR2DS2、KIR2DS4 基因各有 1 例误检。

图 1 短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法扩增结果Figure 1 The results of KIR genotyping by PCR-SSP that amplified short DNA fragments

表 2 短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法检测 330 例湖南汉族健康人群的基因频率分布Table 2 The distribution of KIR gene frequencies detected by PCR-SSP that amplified short DNA fragments in 330 healthy population of Hunan Han

短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法检测 KIR2DS4 基因的 3 类等位基因的阳性率分别为：KIR2DS4*001（41%）、KIR2DS4*003/004/006/ 007（34%）和 KIR2DS4 杂合子（19%）；而长片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法不能区分KIR2DS4 等位基因。

表 3 长（L）、短（S）片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法的比较Table 3 The positive rate of KIR genes by PCR-SSP method that amplifies long (L) and short (S) DNA fragments

表 4 长（L）、短（S）片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法检测结果的差异性分布Table 4 The differences in the distribution of KIR genes results by PCR-SSP method that amplifies long (L) and short (S) DNA fragments

3 讨论

KIR 基因属于常染色体共显性遗传，位于人类染色体 19q13.42，长约 100 ～ 200 kb，具有高度多态性。已明确的 KIR 基因共 16 个，包括 14 个功能基因（KIR2DL1-5、KIR3DL1-3、KIR2DS1-5、KIR3DS1）和 2 个假基因（KIR2DP1、KIR3DP1），形成以 KIR3DL2 和 KIR3DL3 基因分列染色体端粒端和着丝粒端，KIR2DL4 和 KIR3DP1 基因居中的框架格局，各 KIR 基因的规律组合又可形成 KIR 基因 A 和 B 两种单倍型[4]。KIR 基因表达产物—— KIR 受体对 NK 细胞和部分 T 细胞活性调节起着重要作用，故检测 KIR 基因对感染、肿瘤和自身免疫病发病机制探讨、发病预测、治疗及造血干细胞移植具有临床指导意义。

1997 年 Uhrberg 等[5]首次建立 PCR-SSP 方法检测 KIR 基因。其后的研究者在改良 PCR-SSP方法的同时，探索多重 PCR-SSP、序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应（PCR-SSOP）、RT-PCR 等检测法[6-8]。但这些方法都存在一定的局限性，主要表现在 PCR-SSOP 与 RT-PCR 方法需要特定的仪器，且试剂、耗材较贵；而 PCR-SSP 方法虽简单易行、经济，但因其既往所采用的引物不能检测出近年新发现的 KIR 基因的等位基因和座位，且扩增产物多为长片段，对样本基因组 DNA 要求高，存在漏检和误检的可能。为此，我们在 Vilches等[2]前期工作基础上建立短片段扩增 KIR 基因的PCR-SSP 分型法。本研究显示，该分型法准确可行，与长片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法相比，其对 KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1基因漏检率和误检率明显降低，且可在同一 PCR反应管内检测 KIR2DS4*001、KIR2DS4*003/004/ 006/007 及 KIR2DS4 杂合子。

KIR2DS4 基因是 KIR 基因单倍型 A 的成员之一，编码激活性 KIR2DS4 受体。研究报道其与成人隐匿性自身免疫糖尿病、丙型肝炎、慢性粒细胞白血病、非白血性白血病、类风湿性关节炎等疾病密切相关[9-13]。在 KIR2DS4 等位基因中，只有KIR2DS4*001 具有正常结构，其他等位基因均因有长约 22 bp 片段的缺失（缺失型）使外显子 5 读码框移位，而不能起到激活膜受体的功能[14]。这两类等位基因在人群中的分布不均，高加索人群以缺失型等位基因为主，而亚洲和非洲等人群则以KIR2DS4*001 为主[15]。本研究发现中国湖南汉族健康人群中 KIR2DS4 基因频率为 94.2%，其等位基因中 KIR2DS4*001 为 46.1%、KIR2DS4*003/ 004/006/007（缺失型）为 19.4%、KIR2DS4 杂合型为 28.8%，为进一步研究 KIR2DS4 基因在以上疾病发病机制中的作用提供了线索。

基因遗传背景与种族、地区、疾病等因素相关。明确某一种族、某一地区健康人群 KIR 基因的分布情况，是研究该种族和地区人群 KIR 基因与疾病关系的基础。本研究在国内外首次大样本量检测了中国湖南汉族健康人群中 KIR 基因的分布频率。结果发现 KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3 和KIR3DP1 基因的检出率均为 100%，与国内外其他人群报道一致[16-21]，也符合这 4 个基因为结构性基因的特性。KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS4 和 KIR2DP1 基因频率均高于 90%，而KIR2DL2、KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1 基因频率均低于40%。KIR 基因在中国湖南汉族健康人群中的分布频率与国内其他地区汉族人群（上海、浙江等）以及日本人群相似[16-18]，而与高加索人群差别较大，其中 KIR2DL2、KIR2DS2、KIR2DS3 基因频率低于高加索人群，而 KIR2DL3 基因频率高于高加索人群[19-21]。关于湖南汉族健康人群 KIR 基因型、单倍型的分布和 KIR 基因连锁不平衡问题，我们将在下一步研究中进一步分析。

综上所述，短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP分型法相对简单、易行、准确，为进一步探讨 KIR基因在不同种族健康人群中的差异，以及研究其遗传背景对疾病和造血干细胞移植的影响有着重要的理论意义和实践价值。

志谢 感谢中南大学湘雅医学院免疫学教研室田伟教授给予的帮助和指导

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PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments for KIR gene

TAN Yu-yu, LIN Jian, JIN Rong-chen, TANG Wei-li, HUANG Gan, PENG Jian, ZHOU Zhi-guang

ObjectiveTo establish a polymerase chain reaction-sequence specific primer (PCR-SSP) method that amplifies short DNA fragments for killer cell immunoglobin-like receptor (KIR) gene.MethodsBlood samples were obtained for DNA extraction from 330 healthy volunteers of Hunan Han. The specific primers that amplified short DNA fragments of KIR genes were synthesized and 16 KIR genes were genotyping by PCR-SSP method, and analyzing the distribution of KIR gene frequencies in Hunan Han population. Then 100 samples were randomly selected from the 330 DNA samples for comparing the positive rates of KIR genes between the PCR-SSP methods that amplified long and short DNA fragments.Results①The PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments could detect all KIR genes. The PCR products showed clear strips; ②In the healthy Hunan Han population, the positive rates of KIR2DL4, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR3DP1 genes were all 100%, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DS4, KIR2DP1 genes were with high positive rates as 96.4%, 96.1%, 94.2%, 94.2%, 99.7%, respectively. The positive rates of KIR2DS1, KIR2DL5, KIR3DS1, KIR2DL2, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5 genes were all lower than 40%; ③The PCR-SSP methods that amplified long and short DNA fragments (the long/short fragments method) could both detect 16 KIR genes and presented consistent positive rates in KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1, while low positive rates in other KIR genes by the long fragments method. Compared with the long fragments method, the positive rates of KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1 genes by the short fragments method were improved (94% vs. 84%、40% vs. 26%、94% vs. 62%、38% vs. 20% respectively, all P ＜ 0.05), and the misdiagnosis rate and the rate of miss diagnosis were cut down by the short fragments method.ConclusionThe PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments is simple, feasible, accurate and practical, and has a good value.

Receptors, KIR; Polymerase chain reactionr; Gene

ZHOU Zhi-guang, Email: zhouzg@hotmail.com www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):165-170

欧洲糖尿病研究基金（EFSD 2008）；国家重点基础研究发展计划（973 计划）（2006CB503901）；国家高技术研究发展计划（863 计划）（2006AA02A409）；湖南省高校科技创新团队项目（2008）

410011 长沙，中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所/中南大学糖尿病中心/中南大学代谢综合征研究中心

周智广，Email：zhouzg@hotmail.com

2010-02-02

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.001

方法选取 330 例湖南汉族健康志愿者血液标本，提取基因组 DNA；合成短片段扩增 KIR 基因的序列特异性引物，采用 PCR-SSP 分型法扩增已知的 16 个 KIR 基因，分析湖南汉族人群KIR基因的频率分布特征。从 330 例 DNA标本中随机选取 100 例，比较长、短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法检测基因的阳性率差异。

结果①短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法可检测出所有 KIR 基因，扩增产物条带清晰，结果准确；②湖南汉族健康人群 KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因阳性率均为 100%，KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS4、KIR2DP1 基因阳性率分别为 96.4%、96.1%、94.2%、94.2% 和 99.7%，而 KIR2DS1、KIR2DL5、KIR3DS1、KIR2DL2、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5 基因阳性率均＜ 40%；③长、短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法（长、短片段方法）均可检测出 16个 KIR基因，且KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1 基因的阳性率一致，但长片段方法检测其余 KIR 基因的阳性率均低于短片段方法，其中短片段方法检测 KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1 基因阳性率均明显高于长片段方法（分别为 94% vs. 84%、40% vs. 26%、94% vs. 62%、38% vs. 20%，均 P ＜ 0.05），同时漏检和误检降低。

结论短片段扩增 KIR 基因的 PCR-SSP 分型法简单、易行、准确，具有良好的应用价值。

Author Affiliation: Institute of Metabolism and Endocrinology, Diabetic Center, Metabolic Syndrome Research Center, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China