电子基因芯片 DNA 等温扩增技术检测大肠埃希菌 O157∶H7 方法建立

曹娜娜，黄红兰，赵春燕

·技术与方法·

电子基因芯片 DNA 等温扩增技术检测大肠埃希菌 O157∶H7 方法建立

曹娜娜，黄红兰，赵春燕

Nanogene 公司研制的电子基因芯片利用电子场、热循环或化学技术等吸引带负电的 DNA、RNA 或其他生物分子和探针结合到芯片特定位点上进行杂交检测[1]。Nanogene电子芯片具有精确性和严谨性，对生物分子的电子吸引力大大加速了分子结合到芯片上的速度，与传统的被动式芯片（如 Affymetrix、Genechip）相比，提高了 1000 倍以上。通常被动式芯片的点样需要花几个小时，而主动式电子芯片仅需要 30 ～ 60 s。

我们曾建立了一种等温网状分枝扩增技术（ramification amplification method，RAM），该方法利用环形探针和捕获探针分离和检测靶序列，当环形探针与靶基因结合时，在连接酶的作用下以共价键连接成环状。然后，延着环形探针聚合酶延伸连接的正向引物，置换下游链，产生多聚 ssDNA，这个过程类似噬菌体体内复制过程。再以多聚 ssDNA 作为模板，反向引物与它杂交、延伸、置换下游链，产生大的分枝复合物，导致指数级扩增，整个反应在等温条件下进行[2]。RAM 具有和 PCR 一样的灵敏度，而且等温扩增不需要温度循环仪，在任何条件下均可进行扩增反应。在本实验中，我们将 RAM 方法与电子芯片有机结合起来，在电子芯片上进行 RAM 扩增，以大肠埃希菌的产志贺样毒素 O157志贺毒素基因 2（shiga toxin 2，stx2）作为检测靶基因，确定该方法的可行性，使电子芯片技术有更广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 从临床标本和食品中分离的 33 株菌株，其中 E.coli O157∶H7 23 株，E.coli O26∶H11 2 株，E.coli O111∶NM 1 株，痢疾志贺菌 3 株，血清型未确定的 4 株，分别由美国马里兰大学和中国疾病预防控制中心流行病所惠赠及本室分离鉴定保存；大肠埃希菌 ATCC23716 作为阴性对照菌株。

1.1.2 试剂 异硫氢酸胍、0.5% 牛血清白蛋白、0.5% 十二烷基钠、组氨酸缓冲液、DMSO 均为美国 Sigma 公司产品；Taq DNA 连接酶、Bst DNA 聚合酶为美国 New England Biolabs 公司产品；T4 Gene 32 蛋白为美国 United States Biochemical 公司产品；dNTP 为北京鼎国生物技术有限责任公司产品；EDTA 为美国 Gibco 公司产品；Tris 为长春宝泰克生物科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 Nanogen 电子芯片工作系统 Nanogen 电子芯片工作系统包括三个部分：微电子芯片、上样系统和检测系统。微电子芯片是由 100 个或 400 个位点组成的半导体微电子芯片。上样系统是通过电流将带负电荷的 DNA 分子从96 孔板上样到微电子芯片上。检测系统是用于检测荧光信号的强度，还可以通过提高反应温度和低盐溶液洗涤降低非特异性杂交和背景干扰。微电子芯片固定在一个卡套内，表面的位点是由许多微电极构建，微电极间由微电路连接，通过对微电极的电位控制，在微电极的上方完成探针分子的选择性固着、靶核酸定向转移集中并与探针主动杂交，未杂交或错配杂交序列的去除等过程。

1.2.2 标本处理 将菌株在血琼脂培养基上 37 ℃ 培养24 h，挑取单个菌落放在离心管中，用生理盐水洗 2 次，然后溶于 100 μl 5 mol/L 异硫氢酸胍（guanidium thiocyanate，GTC），0.5% 牛血清白蛋白，80 mmol/L EDTA，400 mmol/L HCl（pH 7.5），0.5% 十二烷基钠，100 ℃ 煮沸 10 min，60 ℃ 过夜，将裂解的标本 –20 ℃ 保存备用。

1.2.3 环形探针、靶基因、引物和检测探针与报告探针的设计 根据志贺样毒素 2 基因（GenBank #X07865）设计环形探针和捕获探针，环形探针两端与靶基因互补区为25 个碱基，连接区大约为 70 个碱基。RAM 引物序列参考文献[3-5]，具体序列见表 1。以上探针和引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.4 在电子芯片上 RAM 反应过程 将下面的各种反应液、洗液加到同一个 96 孔板的不同孔内，进行如下反应：

表 1 环形探针、RAM 引物、合成靶基因及探针序列

将生物素标记的上游引物结合到芯片的不同位点上，电流为 0.6 μA，60 s，然后用 50 mmol/L 组氨酸洗涤芯片4 次；将 25 mmol/L 磷酸化环形探针和 1 μl 靶基因结合到已结合了引物的位点上，电流 0.995 μA，120 s，再用50 mmol/L 组氨酸洗芯片 4 次；将连接反应液结合到上述芯片位点上，反应液包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6），25 mmol/L 乙酸钾，10 mmol/L 乙酸镁，10 mmol/L DTT，1 mmol/L NAD，1 mmol/L TritonX-100，10 U Taq DNA 连接酶，电流 0.9 μA，120 s，然后将反应温度提高到 60 ℃，反应 10 min；降低芯片温度至室温，用 0.5 mmol/L KiPO4（435 mmol/L K2HPO4和 65 mmol/L KH2PO4）洗涤芯片4 次；将 RAM 反应扩增液结合到上述芯片位点上，扩增液包括：300 μmol/L dNTP，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8），10 mmol/L KCl，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100，1.2 μmol/L 正向引物，1.2 μmol/L 反向引物，6.4 U Bst DNA聚合酶，4 ng T4Gene32 蛋白，6% DMSO。电流 0.9 A，120 s，反应温度 60 ℃，反应 10 min。最后将检测探针和报告探针分别结合到上述芯片位点进行检测，电流 0.9 A，120 s。

2 结果

2.1 不同浓度的引物对芯片上 RAM 扩增的影响

为了确定引物最佳反应浓度，我们将不同浓度的生物素标记引物 500、250、125、62.5、31 nmol/L 结合到芯片不同位点上，且每个引物结合四个相同的位点，然后将磷酸化的环形探针和合成的靶基因结合上述位点上，每个位点的连接反应和扩增反应是一致的，结果见图 1。从图 1 可见，随着引物浓度的增加，RAM 扩增效率也随着增加，当引物浓度达到 125 nmol/L 和 250 nmol/L，RAM 扩增效率较高（F = 3.659，P ＜ 0.01），因此，在以后实验中我们所用的引物浓度为 125 nmol/L。

2.2 电子芯片 RAM 扩增特异性分析

我们先将相同浓度（125 nmol/L）的生物素标记引物结合到芯片上，然后再分别将磷酸化环形探针与不同菌株的靶基因，包括产志贺毒素 2 的 E.coli O157∶H7，不产志贺毒素 2 的 E.coli O26∶H11、E. coli O111∶NM、痢疾志贺菌和E.coli ATCC23716 分别结合到已结合了引物的位点上，进行 RAM 扩增，结果见图 2。从图 2 可见，只有产志贺毒素 2 的 E.coli O157∶H7 扩增效率最高，而其他的菌株未被扩增，表明在芯片上 RAM 的扩增是对特异的靶基因扩增（F = 1.275，P ＜ 0.01）。

2.3 在电子芯片上进行 RAM 扩增检测临床标本和食品中分离的大肠埃希菌 O157：H7

我们利用电子芯片 RAM 扩增技术检测了临床标本和食品中分离的大肠埃希菌 O157∶H7 志贺毒素 2 基因，见图 3。从图 3 可见，在芯片位点可见到较强的荧光即为检测志贺毒素 2 基因阳性的 O157∶H7。

图 2 电子芯片 RAM 特异性检测

图 3 电子芯片 RAM 扩增检测临床标本和食品中分离的大肠埃希菌 O157∶H7

3 讨论

近年来，DNA 基因芯片技术广泛用于基因表达的检测，而且这些 DNA 基因芯片检测技术通常先进行基因扩增，然后再通过杂交检测扩增产物。它们通常用于检测一个生物基因组中的很多基因，普通的 DNA 芯片技术都是被动地将基因杂交到芯片上，而且一个样本被杂交到整个芯片上，因些这种方法不能用于在同一个芯片上检测多个病原体。电子 DNA 芯片技术能克服常规基因芯片的不足，它是将 DNA 主动地杂交到芯片指定位点上，这样在电子芯片上可进行多重性分析，在同一个芯片上可同时检测一个样品的多个基因，或一个基因的多个样品，或多个样品的多个基因。目前 Nanogene 电子基因芯片技术已用于多种检测如单链置换扩增分析[6]、单核苷酸多肽性分析（single nucleotide polymorphism，SNP）[7]、点基因突变、基因表达图谱[8]、简单串联重复序列分析[9]、免疫学检测以及病原生物检测[10]。

在本实验中，我们将 RAM 与电子 DNA 芯片技术结合起来，在电子 DNA 芯片上进行 RAM 扩增并检测扩增产物，节约了反应时间。实验结果表明，当生物标记的引物浓度为 125 mmol/L，RAM 扩增效率达到最高，荧光强度最强。而且我们将不同菌株靶基因结合到芯片上，结果表明，只有产志贺毒素 2 菌株靶基因的扩增效率最高，证实在电子芯片上 RAM 扩增是依赖于特异的靶基因，说明 RAM具有较高的特异性。而且我们又进一步在电子芯片上用RAM 检测了临床标本和食品中分离不同的 E.coli O157∶H7菌株，证实了此种方法的可行性，我们将该方法进一步完善，使之有更广泛的临床和科研应用前景。

参考文献

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[4] Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, et al. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol, 2002, 40(1):128-132.

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[7] Cooper KL, Goering RV. Development of a universal probe for electronic microarray and its application in characterization of the Staphylococcus aureus polC gene. J Mol Diagn, 2003, 5(1):28-33.

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[9] Radtkey R, Feng L, Muralhidar M, et al. Rapid, high fidelity analysis of simple sequence repeats on an electronically active DNA microchip. Nucleic Acids Res, 2000, 28(7):E17.

[10] Takahashi H, Norman SA, Mather EL, et al. Evaluation of the NanoChip 400 system for detection of influenza A and B, respiratory syncytial, and parainfluenza viruses. J Clin Microbiol, 2008, 46(5): 1724-1727.

基金项目：吉林省卫生厅项目（2008Z001）

作者单位：130021 长春，吉林大学白求恩医学院病原生物系

通讯作者：赵春燕，Email：chunyanzhao44@yahoo.com

收稿日期：2010-09-21

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.012