重组转铁蛋白的研究进展

谢俊，黄英

重组转铁蛋白的研究进展

谢俊，黄英

转铁蛋白家族存在于脊椎和无脊椎动物中。该家族蛋白是由血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳转铁蛋白、黑色素转铁蛋白、碳酸酐酶抑制因子等构成[1]。血清转铁蛋白（serum transferrin）在人、罗猴、狗、猫、兔、荷兰猪、小鼠、大鼠、奶牛、绵羊、山羊、马、火鸡、鸭、海龟和响尾蛇中均有存在，主要由肝细胞合成，分布在胆汁、羊水、脑脊液、淋巴液、初乳和乳汁中，但血浆中含量最高（2.5 g/L），占血浆总蛋白的 4%，从血浆蛋白质的含量看，列第四位。由于转铁蛋白具有铁的转运，抗菌活性，免疫调节活性等多种生物功能，并且转铁蛋白和转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）在药物中转运方面也有特殊功能，其在临床上的应用越来越多，因此，人转铁蛋白（human transferrin，hTF）的临床应用及重组人转铁蛋白的研究已成为近年来生物工程技术研究领域的一个新热点。

1 人转铁蛋白的结构和功能

1.1 人转铁蛋白的结构

人转铁蛋白基因的大小为 33.5 Kb，包含 17 个外显子和 16 个内含子，mRNA 长 2318 bp，基因定位于3q21-qter[2]。hTF 是一种非血红素结合铁的 β-球蛋白，由679 个氨基酸残基构成，分子量为 79 （kD），含有 19 个分子内二硫键和三个分子外糖链（其中两个聚糖通过与 413和 611 位 Asn 的酰胺基相连，另外一个聚糖与 42 位 Ser的 O 相连）[3]。hTF 分子形成 N 端（336 个氨基酸）和C 端（343 个氨基酸）2 个结构域，这 2 个结构域有 42%的同源性。每个结构域含有一个三价铁离子结合位点，可逆地结合和释放铁离子。

1.2 人转铁蛋白的生物学功能

血清转铁蛋白其主要生理功能是负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，并以 TF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成或输送到机体的其他需铁部位[4]。TF 也具有抗菌的活性。机体内自由铁含量过高会促进病原物的生长，转铁蛋白结合自由铁可作为一种减少细菌病原体感染的手段[5]。TF 还可作为生长因子，几乎所有细胞株在无血清培养时，都需要人血清 TF 和胰岛素的存在，并且不同类型的细胞对 TF 结合物的反应不同，结果会分化成不同的细胞[6]。自由铁离子和其简单的配合物能催化 ·OH 的形成而使细胞具有毒性，但 TF 因能与游离铁形成稳定的铁—转铁蛋白配合物，故具有清除有害的游离铁离子，抑制自由基所产生的细胞毒性作用。TF 还具有免疫调节活性。阻断 TF 介导的铁摄取能有效抑制淋巴细胞增殖。并且 Yun 等[7]还证实：在各种诱导物如脂多糖、肽多糖、病毒作用下，家蚕的转铁蛋白 mRNA 表达量显著增加，说明家蚕的免疫反应与转铁蛋白有关。

2 人转铁蛋白在临床上的治疗应用

2.1 疾病诊断

人体中铁缺乏或者铁超负荷都会产生疾病，如患者血浆中缺乏转铁蛋白，就会导致出现小细胞低色素性贫血和肝、脾、胰腺等脏器中大量铁蓄积。因此，在临床诊断中，检测转铁蛋白受体和铁蛋白是缺铁性贫血和慢性疾病引起的贫血（ACD）的鉴别诊断的指标之一；在慢性肝疾病及营养不良时转铁蛋白下降，转铁蛋白的检测也可以作为营养状态的一项指标。另外，测定尿转铁蛋白排泄率的变化可以更早地反映 II 型糖尿病患者的早期肾损害，而血清转铁蛋白的降低也可用来诊断肾脏病变的严重程度。

2.2 疾病治疗

由于转铁蛋白具有多种生物学功能，在一些临床疾病的治疗中应用广泛。当机体缺乏转铁蛋白时，会出现贫血；铁超负荷，生长滞后和高感染的危险，而通过注入脱铁转铁蛋白（apo-Tf）可有效地治疗缺乏转铁蛋白贫血症[5]。在缺血性疾病抢救和治疗过程中，医学家们逐渐发现，缺血所引发的组织损伤是疾病致死的主要原因，但组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，由于过量的自由基攻击重新获得血液供应的组织内的这部分细胞所造成的；而自由铁离子能催化氧自由基形成，提高氧自由基的浓度。脱铁转铁蛋白可与自由铁离子结合，降低氧自由基的浓度，减少组织的氧化还原损伤。因此，在疾病抢救和治疗过程中注入脱铁蛋白对缺血性再灌注损伤有很好的促进作用[7]。同样在放射治疗过程中转铁蛋白含量减少，自由铁离子浓度增高，注入脱铁转铁蛋白结合铁离子也可以降低氧化损伤[8]。在患者骨髓移植或者化疗治疗血液肿瘤过程中，由于体内高浓度的自由铁离子，影响了正常血清对条件致病菌的抑制作用，很容易导致细菌感染而使患者死亡，而注入脱铁蛋白可降低自由铁离子浓度，则可恢复血清对病原菌的抗性[9]。

2.3 肿瘤治疗

研究发现，在许多增生细胞表面，幼红细胞以及很多的肿瘤细胞上都发现了转铁蛋白受体（TfR），并在白血病患者的细胞，转移率高的赘生细胞和许多肿瘤组织中发现了TfR 过表达的现象。因此 TfR 成为了很好的肿瘤靶向标记[10-11]。谢伟玲等[12]将转铁蛋白与苯甲酸酰肼结合形成靶向药物，通过甲基噻唑基四唑（MTT）法检测其对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞的杀伤效果。研究结果还显示转铁蛋白与苯甲酸酰肼结合的药物对乳腺癌细胞的杀伤效果是正常细胞的 286 倍。因此，科学家利用转铁蛋白作为载体直接运输小分子量的药物和毒物蛋白，或者通过脂质体把药物连接在抗转铁蛋白的抗体上，使带有药物和毒物蛋白的转铁蛋白与肿瘤细胞上的转铁蛋白受体结合，将药物运输到特定的肿瘤部位，达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。然而，转铁蛋白和转铁蛋白受体复合物代谢循环较快，每次循环大约 4 ～5 min，影响了药物运输的效率。并且结合铁离子的 TF 与TfR 结合进入细胞内后，释放铁离子成为脱铁转铁蛋白（apo-TF）回到细胞表面。但如果 apo-TF 与 TfR 亲和力低不能继续参与代谢，而每个转铁蛋白分子限制在 4 ～5 min 的循环过程，这就给转铁蛋白与细胞毒物缀合物的运输带来了困难。Yoon 等[13]用基因工程改造转铁蛋白的受体，增加转铁蛋白在细胞内停留时间，降低铁离子的释放速率，来提高转铁蛋白转运细胞毒物的效率，以增强杀伤肿瘤细胞的治疗效果。所以，利用基因工程、免疫、组织化学等技术修饰转铁蛋白或者转铁蛋白抗体，使其高效特异地携带药物、细胞毒物、基因片段等，将为癌症治疗带来新的曙光。

3 重组人转铁蛋白的研究

转铁蛋白参与免疫系统的调节，具有抗菌、杀菌、自我保护的抗病性能，是抑制细菌繁殖的重要因子；近年来还发现 TF 是细胞生长和增殖所必需的生长因子，所以在无血清细胞培养液中 TF 是必需的成分以确保细胞的生长和增殖；并且转铁蛋白或者转铁蛋白受体介导的药物传递对糖尿病及肿瘤等疾病有很好的临床效果；同时，转铁蛋白还具有防止贫血、促进双歧杆菌的生长、抑制肠道致病菌和病毒体内自由基的生成、缓解类风湿关节炎和抗衰老等生理功能，被广泛应用于食品、药品、化妆品和医药领域中。因此，转铁蛋白已经成为国际上竞相研发的生物制品。但目前 TF的获取主要来自献血者的血浆之中。可血源的供应困难，以及有感染肝炎病毒和艾滋病病毒等的危险，限制了通过血浆来大量获得 TF 蛋白的可能。利用基因工程技术让人转铁蛋白基因在宿主中高效表达，既能大量获得重组转铁蛋白，又能克服从血清中获取的 TF 携带有传染性的致病菌的危险。由于人转铁蛋白的治疗和保健功能，因而对转铁蛋白的研究在急剧升温，它已经成为新世纪生命科学发展的最大热点。王峰和黄璐圆[14]以人胎肝 cDNA 为模板，利用 PCR 方法克隆人转铁蛋白基因；通过与基因组序列对比分析基因组结构，发现人转铁蛋白基因与猩猩、猴子、兔子和老鼠的转铁蛋白氨基酸相似率分别为 94%、91%、78%、73%。近些年来，重组人转铁蛋白表达系统的研究主要有以下几个方面：

3.1 大肠杆菌表达系统

de Smit 等[15]用仅在 28 ℃ 可表达 hTF 质粒的启动子，替换了常规的 42 ℃ 下表达的温敏型质粒的启动子，使得培养液的温度不必升高到 42 ℃。虽然 42 ℃ 可以激活许多蛋白酶的活性但也可促进蛋白质的降解。因此，在 28 ℃培养液中有利于提高蛋白质的合成。同时将 28 ℃ 温敏型的质粒转化入蛋白酶缺陷型的大肠杆菌株内生产 rhTF，这样很好地避免了菌株自身对 rhTF 的降解作用。通过这两种方法的改进，使转铁蛋白的表达量达 60 mg/L。但是由于细菌不含有粗糙内质网及高尔基体，不能把 N 聚糖连到肽链上，所以该重组的人转铁蛋白不具有生物活性；尽管Hoefkens 等[16]通过分离、复性实验证实：复性后的重组转铁蛋白与标准品具有一样的组成，并且纯度高，具备结合铁离子的功能，但复性的产率只有 5%。因此，由于包涵体具有不易溶解以及表达无活性的 hTF 复性成有活性的 hTF产率低等缺点，不能应用大肠杆菌大规模的表达 hTF。

3.2 酵母表达系统

由于酵母表达系统培养条件普通，生长繁殖速度迅速，而且酵母表达的转铁蛋白 N 端纯化简单，成本小，还可完全去除血清；因此，酵母可作为 hTF 很好的表达系统。Mason 等[17]构建以甲醇氧化酶为启动子的 hTF/2N cDNA载体，用甲醇酵母表达转铁蛋白的 N 端，在甲醇的诱导下，摇瓶的培养液中检测到其表达量为 150 ～ 240 mg/L。虽然表达量比较理想，但仅表达有功能的人转铁蛋白的 N 末端，全长蛋白的表达并未成功，而且质谱法检测出 N 末端含有1 ～ 2 个人转铁蛋白中并不存在的己糖。Sargent 等[18]通过敲除两个与 N 相连的糖基位点，从啤酒酵母中纯化出全长的转铁蛋白，表达量达到 1.5 mg/ml，已达到了商业化生产的标准，但是这种纯化所需的微孔及膜抗原非常昂贵。

3.3 细胞表达系统

黑腹果蝇 S2 细胞的特点在于它能自发地把数百种转染过的质粒拷贝整合到自身基因组上。随着整合基因数量的扩增，稳定整合多克隆质粒的细胞其表达始终能保持较高的水平，却不会杀死细胞。Lim 和 Cha[19]构建以果蝇金属硫蛋白为启动子的重组人转铁蛋白质粒，用不同浓度的诱导物—硫酸铜，在不同的 S2 细胞浓度下检测重组人转铁蛋白的表达量。结果发现诱导物浓度越高，细胞浓度越大，表达量越高；在 S2 细胞培养 72 h 后到达对数生长期，诱导物硫酸铜浓度为 700 μmol/L 时，转铁蛋白表达量最高为62 μg/ml。Mason 等[20]利用仓鼠婴肾细胞生产转铁蛋白的氨基端片段，培养液中转铁蛋白的氨基端片段浓度由最初的10 ～ 15 μg/ml 提升到 55 ～ 120 μg/ml，但用免疫血清替代物吸附分离转铁蛋白的氨基端片段，从培养液中只回收了80% 的表达量。因此，尽管细胞表达系统可表达有活性的重组人转铁蛋白，但由于表达量低并且成本过高，限制了其商业化的应用。

3.4 动植物表达系统

3.4.1 植物表达系统 Zhang 等[21]用成熟的 hTF 蛋白的氨基酸序列逆翻译为水稻基因偏好的密码子的 DNA 序列（与野生型的 hTF 核苷酸序列相比 GC 含量由 50% 提高到 65%）。然后构建含有种子存储蛋白的启动子序列（Gt1）、Gt1 信号肽、合成的 hTF，终止序列的线性的人重组转铁蛋白（rhTF）表达载体，采用电转染法转入水稻的愈伤组织，结果在转基因水稻后代的种子中检测到了 rhTF，表达量为种子干重的 1%，远远超过了 Farran 等[22]提议的植物中表达重组蛋白可以进入商业化应用的临界线—种子干重的 0.01%。并且通过盐缓冲液萃取及阴离子交换色谱纯化，重组转铁蛋白的纯度达到 95% 以上，不但结构上和天然人转铁蛋白相似，在可逆结合铁离子及促进细胞的生长和分化的功能方面也基本相同。因此，现已有利用水稻表达重组转铁蛋白这种既安全且成本低的方法进行产品开发。

3.4.2 动物乳腺生物反应器研制 动物乳腺作为外分泌器官，由于乳汁不会进入体内循环，而是随乳汁分泌而排出动物体外，故不会影响转基因动物本身生理代谢反应；动物乳腺组织还具备一整套对蛋白进行修饰和加工，如糖基化、羧化、磷酸化以及分子组装修饰加工的能力，具有稳定的生物活性；而且从奶牛中提取产品，操作比较简单，生产成本较低。因此，利用动物乳腺生物反应器生产医用、保健蛋白受到了生物科学家、医药产业界的高度重视。上海交通大学医学遗传学研究所自 20 世纪 90 年代初期就开展了乳腺生物反应器研究工作，构建了在乳腺中能高效、特异表达重组人转铁蛋白基因的载体，不仅获得了整合并表达人转铁蛋白基因的转基因小鼠，之后应用催乳素转基因小鼠与人转铁蛋白转基因小鼠交配，得到双重杂合子的转基因小鼠，结果TF 转基因小鼠乳汁中人转铁蛋白表达水平明显提高[23]。近年来，该研究所又建立了大动物（牛/羊）生物反应器研制重组人转铁蛋白的技术平台，并运用体细胞核移植克隆技术，获得了数头转有人转铁蛋白（TF）的转基因克隆牛。图 1 中显示了转基因动物研制的基本技术路线；表 1 中总结了 rhTF 在不同表达系统中的表达情况。

图 1 转基因动物研制的基本技术路线

表 1 rhTF 在不同表达系统中的比较

4 展望

目前已经利用大肠杆菌，酵母，动物细胞表达了人的重组转铁蛋白，但总体来说蛋白产量低，生物活性差，不具备商业应用价值。而动植物表达系统表达的转铁蛋白具有很好的生物活性，并且成本低，易规模化。因此，构建转铁蛋白的载体，制备转铁蛋白的克隆大动物（牛、羊）获得高表达量、有活性的转铁蛋白将是解决转铁蛋白来源困难的有效途径。虽然现在存在转基因动物外源基因随机整合，表达不很稳定；转基因动物克隆效率低；生物产品纯化回收效率不理想等问题，但我们相信，随着转染技术，定点整合技术，克隆技术及生物分离技术的进步，这些问题将迎刃而解，这将对转铁蛋白及其他药用蛋白的开发有重要意义。利用转基因动物—乳腺生物反应器来生产大量有活性的药用蛋白，基因药物将是基因工程技术发展的一个趋势，具有广阔的应用及市场前景，也对医药产业做出不可估量的贡献。

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基金项目：上海市研发基地协作能力建设专项项目（08DZ2200600）；转基因生物新品种培育科技重大专项（2009ZX08007-003B）

作者单位：200025 上海交通大学医学院（谢俊）；200040 上海市儿童医院上海医学遗传研究所（黄英）

通讯作者：黄英，Email：hying23@163.com

收稿日期：2010-08-13

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.011