甲壳胺抗肿瘤的实验研究

赵丽艳，李明春，孙宇，马守栋，程艳芹，曹恩惠

甲壳胺抗肿瘤的实验研究

赵丽艳，李明春，孙宇，马守栋，程艳芹，曹恩惠

【摘要】

目的研究甲壳胺对 S180 荷瘤小鼠的抗瘤作用。

方法取 S180 荷瘤小鼠 40 只随机分为实验组和对照组，实验组进行不同剂量（50、100、200mg/(kg·d)）甲壳胺灌胃处理，对照组仅灌胃生理盐水，连续 10 d。灌胃结束时检测两组小白鼠的体重变化，观察甲壳胺对腹水瘤小鼠腹水生成的影响，解剖腹腔观察腹水瘤生长情况，HE 染色观察瘤细胞。

结果实验组小白鼠体重大于对照组小鼠体重，腹水量减少，解剖结果显示，实验组腹水瘤块小于对照组，三种剂量的抑瘤率分别是 17.4%、38.8% 和 41.6%。通过对细胞状态的比较，实验组的瘤细胞数目减少，瘤细胞的体积小，变形、死亡细胞增多，核分裂较少见。

结论甲壳胺在体内具有抗 S180 腹水瘤形成的作用。

【关键词】抗肿瘤药； 动物实验； 小鼠

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(6):419-422

甲壳胺（chitosan）是一种天然高分子多糖，也称壳聚糖、几丁聚糖，由氨基葡萄糖经 β-1，4-糖苷键连接而成，是天然多糖中唯一的碱性多糖[1-2]。甲壳胺广泛存在于海洋生物虾、蟹等甲壳类动物的外壳中，人类最早利用甲壳资源始于中国著名的《本草纲目》，其内记载：“蟹壳有破淤消积的功能”。据报道，甲壳胺具有促进凝血和伤口愈合、活化人体细胞、提高人体免疫功能、增强机体耐缺氧能力、清除自由基、抑制癌细胞、防止癌症的复发转移等作用[3-5]。本文通过观察甲壳胺对 S180 荷瘤小鼠体重、腹水瘤生长情况和瘤块细胞的变化，研究甲壳胺对 S180 荷瘤小鼠的抗瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 甲壳胺（纯度 ≥ 95%，脱乙酰化率 ≥ 95%）购自青岛甲壳胺生物技术有限公司；RPMI 1640 培养基购自美国 Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.1.2 实验动物与瘤株 清洁级 BALB/c 纯系雄性小鼠，6 周龄，体重 1923 g，购自青岛市药品检验所实验动物中心[合格证号 SCXK（鲁）20090007]。饲养条件：所有实验动物给予食用全价颗粒饲料，12 h/12 h 光照，自由摄食饮水，温度19 ~ 25 ℃，相对湿度 50% ~ 60%。S180 瘤株由军事医学科学院微生物流行病研究所赵忠鹏博士提供。

1.1.3 实验仪器 SW-CJ-1F 型净化工作台购自江苏苏净集团安泰公司；DODEL2300 型恒温 CO2培养箱购自美国 Shell-Lab 公司；37XA 型倒置显微镜购自上海光学仪器厂；DV215CD 型电子分析天平购自美国 OHAUS 公司。

1.2 方法

1.2.1 S180 瘤株细胞悬液的制备 将 S180 肿瘤细胞复苏、种植传代，待传代至第 6 天，肿瘤生长旺盛时，缓缓抽出约 4 ~ 5 ml 的乳白色血性液体，加入 3 倍的无菌生理盐水稀释，迅速离心，制成 1 ×106/ml 的细胞悬液。

1.2.2 荷瘤动物模型的制备与分组 取 S180 肉瘤细胞悬液，按 1 × 106个/ml、0.2 ml/只无菌接种至小鼠腹腔。次日随机分为对照组（生理盐水）、低剂量处理组（50 mg/kg）、中剂量处理组（100 mg/kg）和高剂量处理组（200 mg/kg），每组10 只。于接种 24 h 后采用灌胃处理。每日处理1 次，连续 10 d。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 小鼠行为以及体重变化 实验组和对照组，从实验开始，观察小白鼠行为及体重变化，将实验组和对照组进行比较，分析各组的体重变化。

1.2.3.2 各组小白鼠腹水瘤腹水量及抑瘤率 无菌抽取腹水，比较腹水量。颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块，表面血污用滤纸吸干，称重，按下式分别计算抑瘤率，抑瘤率 =（对照组平均瘤重 － 处理组平均瘤重）/对照组平均瘤重 × 100%。

1.2.4 HE 染色比较瘤块细胞组织形态学 取中剂量实验组和对照组少量 S180 瘤块细胞，制成瘤细胞悬液，HE 染色，观察实验组和对照组中腹水瘤块状物的细胞形态。

1.3 统计学处理

表 1 实验小鼠体重变化情况Table 1 Change of body weight of mice

表 2 甲壳胺对荷瘤小鼠 S180 肿瘤的抑制作用Table 2 Effect of chitosan on the growth of tumor in S180 mice

2 结果

2.1 甲壳胺对 S180 荷瘤小鼠体重的影响

实验组和对照组小鼠体重变化情况见表 1。与对照组相比，各剂量组小鼠体重均有所增加（P < 0.05）；且观察发现，实验组小鼠的毛色光亮、行动灵敏，明显强于对照组。实验过程中小鼠饮食情况良好，均未观察到血尿和便血。

2.2 甲壳胺对 S180 荷瘤小鼠腹水瘤的影响

实验组小白鼠腹部膨隆程度比对照组膨隆程度小，剖开腹腔后，发现腹腔内脏器变化相似，如肝脏、脾脏和肾脏均有一定程度的萎缩，幅度相同；腹水较对照组少。各组小鼠腹水量、瘤重及抑瘤率结果见表 2。

结果提示，给予低剂量的甲壳胺即能显著抑制腹水的生成（P < 0.01），随着剂量的加大，腹水亦减少，但各剂量组间无显著性差异（P > 0.05）。对各组的瘤体重量进行方差分析，组间存在显著性差异（P < 0.01）。显示甲壳胺在剂量 50 ~ 200 mg/(kg·d)范围内具有抑制小鼠 S180 腹水瘤生长的作用，并且这种作用随剂量的增加而增加。

2.3 甲壳胺对 S180 荷瘤小鼠细胞状态的影响

HE 染色观察实验组瘤块和对照组瘤块结果见图 1。

图 1 瘤块细胞的 HE 染色结果 [A：对照组小鼠瘤块细胞涂片 HE 染色结果（1：S180 瘤细胞；2：死亡的瘤细胞；3：处于分裂状态的细胞）；B：实验组小鼠瘤块细胞涂片 HE染色结果（1：S180 瘤细胞；2：死亡的瘤细胞）]Figure 1 The HE dyeing image of tumor cell [A: The HE dyeing image of tumor cell from the control group (1: S180 tumor cell; 2: Died tumor cell; 3: Splitting tumor cell); B: The HE dyeing image of tumor cell from the treatment group (1: S180 tumor cell; 2: Died tumor cell)]

瘤细胞呈小圆形、胞浆少、核大而染色深。结果显示，实验组和对照组瘤块的细胞成分是一样的，但实验组的细胞数目减少，细胞的体积小，变形、死亡细胞增多，核分裂较少见，说明甲壳胺能抑制瘤细胞的生长。

3 讨论

动物移植性肿瘤体内实验法是检测和筛选抗肿瘤药物的通用方法[6]，本实验用小鼠进行实验，用 S180 肉瘤检测甲壳胺的抗瘤活性。S180 是一种肉瘤细胞株，可在昆明鼠和其他品系的小白鼠体内生长。腹腔接种以腹水型肿瘤生长，接种在实体组织则以瘤块型生长，特别适合于做体内抗瘤实验。

甲壳胺及其衍生物是一类阳离子型天然高分子聚合物。自 1859 年，法国人 Rouget 首先制得后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注。据报道，甲壳胺有良好的生物相容和可生物降解等特性，且本身无毒无害，具有抗菌、抑制肿瘤、免疫调节、抗病毒等药理作用[7-9]。我们发现，甲壳胺处理后的荷瘤小鼠，不仅小鼠的体重有所增加，而且甲壳胺三个剂量组均使荷瘤小鼠的腹水量减少、瘤块重量减轻，中、高剂量组作用更明显。表明甲壳胺可抑制 S180 荷瘤小鼠的肿瘤生长，且其抗肿瘤效应有一定的剂量依赖性，但剂量过大，增加作用就不再明显。通过 HE 染色观察，发现甲壳胺组荷瘤小鼠瘤块的细胞数目减少、细胞变形、体积缩小，证明甲壳胺对动物源性 S180 肉瘤细胞具有抗瘤活性。本实验为下一步研究利用我国丰富的海洋生物资源甲壳胺奠定了基础。

参考文献

[1] Ma SK, Zhou X, Lu HN, et al. Development and problems of research on chitin, chitison and their derivates. J Tianjin Med Univ, 2004, 10(Suppl):12-15. (in Chinese)马世坤, 周旋, 路翰娜, 等. 甲壳素、甲壳胺及其衍生物的研究进展与存在问题. 天津医科大学学报, 2004, 10(增刊):12-15.

[2] Recinos G, Inaba K, Dubose J, et al. Local and systemic hemostatics in trauma: a review. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg, 2008, 14(3): 175-181.

[3] Liu QF, Ren HX, Xue WH. Effect on MCF-7 breast cancer of low molecular N-trimethyl chitosan chloride. Chin J Biochem Pharma, 2006, 27(1):35-37. (in Chinese)刘其凤, 任慧霞, 薛伟华. 低分子季铵化壳聚糖对乳腺癌细胞作用的研究. 中国生化药物杂志, 2006, 27(1):35-37.

[4] Yang JY, Liu JW, Liu CC, et al. Inhibitory effects of carboxymethyl-chitosan on proliferation and in vitro metastatic ability in human highly metastatic lung carcinoma 95-D Cells. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2006, 11(6):640-643. (in Chinese)杨靖亚, 刘建文, 刘承初, 等. 羧甲基壳聚糖对人高转移肺癌细胞—95-D增殖能力和体外转移能力的抑制作用. 中国临床药理学与治疗学, 2006, 11(6):640-643.

[5] Silipo A, Erbs G, Shinya T, et al. Glyco-conjugates as elicitors or suppressors of plant innate immunity. Glycobiology, 2010, 20(4):406-419.

[6] Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacological experimental methodology. 3rd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2002:1757-1779. (in Chinese)徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学(第三版). 北京: 人民卫生出版社, 2002:1757-1779.

[7] Zhou G, Sun Y, Xin H, et al. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus. Pharmacol Res, 2004, 50(1):47-53.

[8] Maeda Y, Kimura Y. Antitumor effects of various low-molecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180-bearing mice. J Nutr, 2004, 134(4):945-950.

[9] Xie Y, Zhou NJ, Gong YF, et al. The immune response induced by H pylori vaccine with chitosan as adjuvant and its relation to immune protection. World J Gastroenterol, 2007, 13(10):1547-1553.

ObjectiveTo determine the antitumor activity of the chitosan to the S180 tumor-bearing mice.

MethodsThe S180 tumor-bearing mice models were established, and were divided into chitosan groups with 3 different doses and control group. The changes of weights and the growth of solid tumors of all groups were detected, and the HE Staining of tumor cells were observed.

Results Compared with the control group, the mice weights of treatment groups increased and the weights of tumor decreased. The inhibition rate was 17.4%, 38.8% and 41.6% at the dose of 50, 100, 200 mg/kg chitosans, respectively. The number of the tumor cells of experimental group reduced. The tumor cells were small, deformed and the dead cells increased. The nuclear division rared.

ConclusionChitosan can prevent the S180 sarcoma in mice from developing.

【Key words】Antineoplastic agents; Animal experimentation; Mice

Author Affiliations:Pharmacy of the PLA 401stHospital, Qingdao 266071, China (ZHAO Li-yan, LI Ming-chun, MA Shou-dong, CHENG Yan-qin, CAO En-hui); Clinical Laboratory of the PLA 305thHospital, Beijing 100017, China (SUN Yu)

Corresponding Author:LI Ming-chun, Email: lmchun401@126.com www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):419-422

基金项目：全军十一五医药卫生科研基金（06MA094）

作者单位：266071 青岛，中国人民解放军第四零一医院药剂科（赵丽艳、李明春、马守栋、程艳芹、曹恩惠）；10001 北京，中国人民解放军第三零五医院检验科（孙宇）

通讯作者：李明春，Email：lmchun401@126.com

收稿日期：2010-09-16

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.004

Research on the antitumor activity of chitosan

ZHAO Li-yan, LI Ming-chun, SUN Yu , MA Shou-dong, CHENG Yan-qin, CAO En-hui

【Abstract】